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On sélectionne alors les peptides synthétiques qui co-éluent avec des peptides naturels de même masse et on vérifie la séquence des peptides naturels par spectrométrie de masse en tandem. En utilisant cette stratégie, l’équipe du PrHG Rammensee a démontré la présence d’un peptide de MAGE-1, KVLEYVIKV, à la surface d’une cellule tumorale HLA-A2. Aucun CTL ayant une avidité suffisante pour reconnaître une cellule tumorale n’a pu être isolé par cette équipe. L’obtention d’un CTL spécifique n’a rien d’une opération évidente : la fréquence d’un CTL spécifique d’un complexe HLA-peptide donné est probablement de l’ordre de 5x10[-8] dans le sang d’un individu sain. Nous avons décidé d’utiliser des multimères HLA-peptide comme outil d’enrichissement de lymphocytes spécifiques rares.
Un peptide de MAGE-1 reconnu par des CTL sur des cellules tumorales HLA-A2
Un multimère HLA-A2 a été construit avec le peptide de MAGE-1, KVLEYVIKV pour tenter d’isoler un clone de lymphocytes T spécifiques. Dans des expériences préliminaires, un grand nombre de lymphocytes T ont été marqués avec un multimère couplé à un fluorochrome, puis avec un anticorps spécifique du fluorochrome couplé à des billes magnétiques. Après passage dans une colonne entourée d’un champ magnétique, les cellules de la fraction positive ont été triées une seconde fois en cytométrie en flux de façon à sélectionner les lymphocytes T CD8 fortement marquées avec le multimère. Des populations clonales ont été obtenues par stimulations antigénique en mircopuits. Malheureusement, de nombreux clones étaient capables de se lier au multimère, mais seule une petite fraction d’entre eux étaient stimulés par des cellules chargées en peptide ou des cellules tumorales exprimant le gène d’intérêt. Ceci est probablement du au fait que les multimères se lient également à des lymphocytes T qui ont une trop faible affinité pour effectuer leurs fonctions effectrices ou pour transduire un signal menant à une prolifération en présence de cellules présentant le peptide.
Nous avons voulu améliorer la technique dans le but d’isoler uniquement des CTL capables de reconnaître des cellules chargées en peptide et de proliférer. Ces expériences sont décrites dans le chapitre 1. Comme précédemment, un grand nombre de lymphocytes T (170 millions) ont été marqués avec le multimère A2/MAGE-1 couplé à de la phycoérythrine (PE), puis avec un anticorps anti-PE couplé à des billes magnétiques. Les cellules ont ensuite été triées par passage dans une colonne entourée d’un champ magnétique. Au lieu d’isoler directement des précurseurs spécifiques par cytométrie en flux et de les cloner, nous avons distribué les cellules de la fraction positive obtenue par tri magnétique et ainsi enrichie en cellules se liant au multimère, dans 96 micropuits contenant chacun environ 8000 cellules. Ces cellules ont été stimulées avec des cellules dendritiques chargées avec le peptide. Après deux semaines de stimulation, les microcultures ont été testées pour la présence de lymphocytes capables de se lier aux multimères. Seules les microcultures où des lymphocytes T étaient capables de proliférer en présence du peptide plus rapidement que les autres cellules, contenaient suffisamment de lymphocytes marqués par le multimère que pour pouvoir être considérées comme positive. Nous avons ainsi obtenu 11 microcultures positives sur 96. Certaines microcultures ont été clonées et 3 clones indépendants ont été obtenus. Ces clones étaient capables de se lier au tétramère, de lyser des cellules chargées avec le peptide et des cellules tumorales HLA-A2 exprimant MAGE-1. Nous avons donc démontré qu’il existe dans le répertoire des lymphocytes T dirigés contre le peptide de MAGE-1 présenté par HLA-A2 ayant une avidité suffisante que pour reconnaître des cellules tumorales. Des vaccinations thérapeutiques pourraient être menées avec ce peptide chez de nombreux patients : les molécules HLA-A2 sont exprimées par environ 45% de la population caucasienne et asiatique et le gène MAGE-1 dans environ la moitié des mélanomes et des carcinomes de l’œsophage et du poumon.
Un peptide de MAGE-4 reconnu par des CTL sur des cellules tumorales HLA-A24
Dans le cadre d’une collaboration avec un groupe japonais, nous nous sommes efforcés d’identifier des peptides présentés par les molécules HLA-A24, qui sont présentes dans 40% de la population asiatique et 20% de la population caucasienne. Ce travail est décrit dans le chapitre 2. Nous sommes partis de l’observation suivante : un peptide de MAGE-1 avait été décrit comme présenté par HLA-A24 à des CTL. En analysant les séquences des autres protéines MAGE dans la région du peptide MAGE-1.A24, nous avons repéré un peptide MAGE-4 contenant des « motifs d’ancrage » pour HLA-A24. Les antigènes de MAGE-4 sont des cibles intéressantes : MAGE-4 est exprimé dans plus de la moitié des carcinomes de l’œsophage, du poumon, de la vessie, et ceux de la sphère ORL. Le peptide a été synthétisé et s’est révélé capable de se lier à HLA-A24. Nous avons ainsi pu construire un multimère HLA-A24 contenant ce peptide et obtenir un clone CTL spécifique en utilisant le multimère comme outil d’enrichissement ainsi que l’approche décrite ci-dessus. Sur 51 microcultures, 3 contenaient des cellules capables de se lier au tétramère. Un clone qui lysait des cellules présentant le peptide de MAGE-4 a été obtenu. Le clone reconnaissait également des cellules tumorales HLA-A24 exprimant MAGE-4, démontrant par là l’avidité suffisante du CTL et le bon apprêtement du peptide par des cellules tumorales. Cependant, seules les cellules traitées avec de l’IFN-gamma étaient reconnues par le CTL. Cela pourrait être partiellement expliqué par une augmentation d’expression des molécules HLA, un phénomène bien connu en présence d’IFN-gamma. Un autre effet connu de l’IFN-gamma est l’induction de l’expression d’un complexe de protéases impliqué dans l’apprêtement des peptides antigéniques, l’immunoprotéasome. Nos résultats pourraient être interprétés de la façon suivante : les cellules tumorales exprimant des immunoprotéasomes apprêtent mieux le peptide de MAGE-4 que celles exprimant des protéasomes standards présents dans les cellules non –traités à l’IFN-gamma. Des expériences ultérieures sont envisagées pour répondre à cette question. Nous pensons en effet qu’il est important de prendre en compte dans les stratégies vaccinales le fait que des antigènes pourraient être apprêtés de manières différentes selon que l’on soit ou non dans des sites inflammatoires où l’IFN-gamma pourrait être présent Identification de gènes codant des antigènes spécifiques de tumeur
Que notre système immunitaire puisse nous débarrasser de certains cancer est un rêve dont les bases expérimentales datent des années 40. En utilisant des lymphocytes T cytolytiques (CTL) isolés d’une patiente ayant guéri d’un mélanome, le premier gène responsable de l’expression d’un antigène de tumeur humaine a été identifié en 1991. Ce gène, MAGE-1, code une protéine dont un peptide est présenté à la surface de plusieurs types de tumeurs mais pas à la surface des cellules normales. Des cellules cancéreuses présentent donc à leur surface des antigènes, absents des cellules normales, qui peuvent servir de cibles à des CTL capables d’éliminer les cellules cancéreuses. Une série de gènes MAGE ont ensuite été identifiés. Ces gènes, comme le gène MAGE-1, sont exprimés dans un grand nombre de tumeurs de types histologiques variés. Ils sont par contre silencieux dans les cellules normales, à l’exception des cellules du testicule et du placenta, que n’expriment pas de molécules HLA et ne présentent donc pas de peptides aux lymphocytes T. Les antigènes provenant des protéines MAGE paraissent avoir les qualités requises pour servir de vaccin contre les cellules cancéreuses car ils sont présents sur de nombreuses tumeurs, ce qui permettrait d’envisager des vaccins applicables à un grand nombre de patients.
Vaccinations thérapeutiques
Plusieurs essais de vaccinations avec des peptides MAGE ont été achevés. Un peptide MAGE-3 présenté par HLA-A1 a été injecté à des malades porteur de mélanomes métastatiques. Sept patients sur 25 ont montré des régressions tumorales dont trois furent complètes et deux perdurent depuis plus de 4 ans. Par la suite, des vaccins contenant d’autres peptides MAGE, de la protéine MAGE-3, un poxvirus contenant une séquence codant des peptides ont été injectés. On peut conclure de ces essais que les vaccinations sont suivies de régressions tumorales chez une minorité de patients et que, parmi les modalités de vaccination testées, aucune ne semble réellement supérieure aux autres. Assez curieusement, les injections de peptide seul, à priori peu efficace pour stimuler une réponse immunitaire, ne sont pas moins efficaces du point de vue clinique que d’autres modalités.
Proposer un vaccin à un plus grand nombre de patients en identifiant de nouveaux peptides antigéniques
Les différents gènes MAGE codent plus que probablement de nombreux peptides antigéniques présentés par diverses molécules HLA. Il est important de continuer à identifier de nouveaux antigènes de tumeurs. Cela permettra bien sûr de proposer une immunothérapie à un plus grand nombre de patients mais surtout, d’utiliser simultanément plusieurs antigènes dans un seul vaccin. L’expression de l’antigène est souvent hétérogène au sein de la tumeur ; un vaccin multi-peptides pourrait donc augmenter l’efficacité de l’immunisation en diminuant le risque de sélectionner des variants tumoraux ayant perdu l’expression du peptide cible. Pour améliorer les méthodes de vaccination, il est également important d’évaluer le nombre de lymphocytes T anti-MAGE activés par la vaccination. Dans le cas où un peptide est injecté, il est possible d’utiliser un outil spécifique et sensible : un complexe soluble HLA/peptide marqué avec fluorochrome.
Différentes stratégies d’identification de nouveaux peptides MAGE ont été mises en œuvre au laboratoire. Il est possible d’obtenir un grand nombre de cellules dendritiques à partir de monocytes sanguins. Ces cellules dendritiques, considérées comme les cellules les mieux équipées pour activer les lymphocytes T naïfs, peuvent être infectées avec des poxvirus ou des adénovirus contenant la séquence codante d’un gène MAGE et utilisées pour stimuler des lymphocytes T autologues. Les microcultures, et ensuite les clones obtenus à partir des microcultures positives, peuvent être criblées pour leur capacité à lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine MAGE d’intérêt. Le clone anti-MAGE est alors utilisé pour identifier le peptide antigénique reconnu et la molécule HLA qui le présente. La dernière étape est de prouver que le clone CTL a une avidité suffisante pour lyser des cellules tumorales exprimant naturellement le gène MAGE et la molécule HLA. Cette approche, basée sur l’expression d’un gène entier et l’apprêtement de la protéine par des cellules dendritiques, facilité l’identification de peptides qui sont aussi présentés efficacement par des cellules tumorales. Par contre, les peptides identifiés peuvent être présentés par des molécules HLA peu exprimées par la population.
Si l’on veut identifier des peptides antigéniques présentés par des molécules HLA fréquentes, on peut utiliser une autre approche qui consiste dans un premier temps à repérer dans la séquence de la protéine des peptides contenant des acides aminés susceptibles d’ancrer ce peptide dans la molécule HLA. En effet, chaque molécule HLA contient des « poches » spécifiques capables d’accueillir des acides aminés spécifiques. Les peptides choisis en fonction de la présence de ces motifs d’ancrage sont synthétisés et testés pour leur capacité à se lier à la molécule HLA. Les peptides capables de se lier sont alors utilisés pour activer des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement le peptide. En utilisant cette approche, le risque est d’isoler les lymphocytes T reconnaissant des cellules chargées en peptide mais incapables de lyser des cellules tumorales exprimant le gène. En effet, il n’existe pas aujourd’hui de bon outil pour prédire les peptides que seront apprêtés efficacement par une cellule tumorale. De rares équipes de recherche ont l’expertise pour démontrer la présence d’un peptide à la surface d’une cellule tumorale. Une stratégie envisagée consiste à synthétiser des peptides candidats et à les analyser par spectrométrie de masse. Parallèlement, des peptides « naturels » sont extraits d’une cellule tumorale, fractionnés par chromatographie HPLC et analysés en spectrométrie de masse.

HLA Antigens --- Antigens, Neoplasm

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Antigens --- Antibodies

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I studied a CD8 cytolytic T lymphocyte clone, named CTL 10, derived from a melanoma patient vaccinated with a MAGE antigen. This CTL was isolated by stimulating blood lymphocytes with autologous tumor cells. The patient displayed a complete tumor regression after vaccination. CTL 10 does not recognize the vaccine MAGE antigen, but is specific for another antigen, not yet identified, present on the tumor cells. The recognition of the tumor cells by CTL 10 is restricted by HLA-A2 molecules.
To identify the antigenic peptide, a cDNA expression library prepared from the tumor cell line, was screened in a transfection assay. Two positive cDNA clones were identified, corresponding to BACE 2 and autophagin 4 gene products.
The goal of this work was to identify the peptide recognized by CTL 10, by preparing sets of minigenes derived from the BACE 2 and autophagin 4 cDNA clones. This lead to the identification of the two regions of these genes that appear to code for the antigenic peptide J'ai étudié un clone de lymphocytes T CD8 anti-tumoraux, nommé CTL 10, obtenu chez une patiente atteinte d'un mélanome. Cette patiente a présenté une régression tumorale complète après vaccination avec un antigène MAGE. Le CTL 10 a été isolé suite à la stimulation de lymphocytes sanguins avec des cellules tumorales autologues. Il ne reconnaît pas l'antigène vaccinal, mais est spécifique d'un autre antigène, pas encore identifié, présent sur la tumeur. Cet antigène est présenté par la molécule HLA-A2.
Le CTL 10, contrairement à d'autres, n'a pas sa fréquence augmentée suite à la vaccination et semblerait donc ne pas avoir d'effet. Afin de comprendre à quels mécanismes cela est dû, j'ai étudié sa restriction antigénique. Par criblage d'une bibliothèque d'expression de la lignée tumorale, deux gènes ont été identifiés comme pouvant contenir des peptides antigéniques : BACE 2 et l'autophagine 4.
Le but de ce travail est d'identifier le peptide exact reconnu par le CTL 10. A partir des deux plasmides contenant ces gènes, j'ai construit des minigènes. Dans un premier temps, j'ai amplifié par PCR l'ADNc encodant une portion du gène d'intérêt. Ensuite, j'ai cloné ce produit de PCR dans un vecteur plasmidique qui a été multiplié à l'aide de bactéries. J'ai alors extrait les plasmides qui ont été cotransfectés avec un ADNc codant pour des molécules HLA-A2 dans des cellules eucaryotes. Par des tests de sécrétion de TNF par le clone CTL 10, on a regardé si ce minigène contenait ou non la séquence codant le peptide antigénique

T-Lymphocytes --- Antigens, Neoplasm

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Antigens --- Protein synthesis --- Antibodies

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MAGE-A1 a été découvert parce qu’il produit un antigène tumoral reconnu par des lymphocytes T cytolytiques. Ce gène appartient à une vaste famille de gènes qui codent des protéines dans un domaine de 170 acides aminés est conservé dans différentes espèces. Le rôle physiologique de MAGE-A1 est encore inconnu. Cependant, des expériences récentes de notre laboratoire ont montré que cette protéine est capable de se lier au co-activateur transcriptionnel SKIP, d’inhiber la transactivation assurée par la portion intracellulaire de Notch et de fixer l’histone déacétylase, HDAC1. Ces résultats suggèrent qu’un rôle possible de MAGE-A1 est de réguler la transcription.
De manière à poursuivre ces observations pour déterminer le rôle physiologique de MAGE-A1 dans deux systèmes de cellules de mammifères en culture, les myoblastes de souris C2C12 et les cellules de rein embryonnaire humain 293.
En exprimant MAGE-A1 dans les cellules C2C12 produisant la partie intracellulaire de NOTCH2 (Notch2-IC), nous voulons étudier l’effet de MAGE-A1 sur un processus de différenciation régulé par NOTCH. Les cellules C2C12 ont la capacité de se différencier en myotubes lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu pauvre en agents mitogènes. Ce processus de différenciation est bloqué par Notch2-IC parce qu’il active les gènes HES et HERP qui produisent des répresseurs inhibant les facteurs de différenciation. Nos résultats montrent que la présence de la protéine MAGE-A1 n’empêche pas les cellules C2C12 de se différencier si ces cellules ne produisent pas Notch2-IC. Cependant, contrairement à nos prévisions basées sur l’observation que MAGE-A1 est capable de contrecarrer la transactivation de Notch1-IC, nous avons observés que MAGE-A1 était incapable de rétablir un processus de différenciation dans des cellules C2C12 bloquées par Notch2-IC. En accord avec ces résultats, des expériences de PCR quantitative ont montré que le nombre de transcrits HES-1 et HERP-2 ne variaient pas dans ces cellules lorsque MAGE-A1 était exprimé.
Dans la deuxième partie de ce travail, nous avions tenté d’utiliser des systèmes commerciaux permettant d’induire l’expression de MAGE-A1 à l’aide de tétracyline dans les cellules de rein embryonnaire humain 293. Nous avons facilement obtenu des clones dans lesquels on pouvait induire la production de grandes quantités de transcrits MAGE-A1. Cependant, nous avons observé qu’en absence d’induction, le niveau d’expression était au moins aussi élevé que celui des cellules de mélanome humain cultivées en laboratoire. Or, nous voulions réprimer totalement l’expression de MAGE-A1 en absence d’induction de manière à éviter des phénomènes de toxicité de la protéine MAGE-A1 observés au laboratoire lorsque cette protéine est présente en grandes quantités dans des cellules humaines en culture. Nous avons dés lors construit deux nouveaux vecteurs recombinants : l’un utilise un vecteur commercial dans lequel on a modifié l’élément de réponse à la tétracycline ; l’autre est un vecteur dans lequel nous avons remplacé le promoteur minimal du virus CMV par un promoteur minimal MAGE-A1. Lorsque nous aurons mis au point des systèmes d’expression inductible de MAGE-A1 présentant un niveau d’expression négligeable en absence d’induction, nous utiliserons ces systèmes et la technologie des microdamiers (microarrays) pour identifier des gènes régulés par MAGE-A1 MAGE-A1 was discovered because it encodes a tumor antigen recognized by cytolytic T lymphocytes. It belongs to a large family of genes encoding proteins with an intra- and interspecies 170 amino acids conserved homology domain. The molecular function of this protein in thus far interacts with transcriptional adaptor protein SKIP, to counteract transactivation by the intracellular part of Notch1 and to bind to histone déacétylase 1. These data suggest that MAGE-A1 has a role in transcriptional regulation.
In order to examine the functional relevance of these observations, we expressed MAGE-A1 in two in vitro systems of mammalian cells, mouse C2C12 myoblasts and human embryonal kidney 293 cells.
Stable expression of MAGE-A1 in parental C2C12 cells and in C2C12 cells expressing the intracellular part of Notch2 (Notch2*-IC) allowed us to study the effect of MAGE-A1 on a differentiation process regulated by Notch. This model relies on the ability of C2C12 myoblasts to differentiate in myotubes when cultures in mitogen-poor medium. This process is blocked by Notch2-IC because it activates the expression of HES and HERP repressors that inhibit the required differentiation factors. According to our results, ectopic expression of MAGE-A1 in C2C12 myoblasts did not affect their capacity to differentiate. However, contrary to our expectations based on the inhibitory effect of MAGE-A1 on Notch1-IC transactivation, MAGE-A1 expression was not able to resume the differentiation process in Notch2-IC-expressing cells. This was confirmed by real-time PCR experiments showing that the amount of HES-1 and HERP-2 transcripts in C2C12 cells was not affected by MAGE-A1 expression.
In the second part of the study, we developed known tetracycline-regulated systems to express MAGE-A1 in human embryonic kidney cells. Induction by the antibiotic could be easily obtained in some selected clones. However, in the absence of induction, these inducible systems yielded a relatively high background level of expression, similar to that measured in melanoma cells cultured in our laboratory. This basal expression level should be tightly controlled in order to avoid toxic effects frequently observed in mammalian cells over expressing MAGE-A1. We therefore constructed two new MAGE-A1 expressing vectors: one is based on a commercial vector with a modified tetracycline response element; the other is a vector containing a MAGE-A1 minimal promoter instead of the current CMV minimal vector. When tightly controlled inducible systems will be available, we will use the microarray technology to identify genes that are regulated by MAGE-A1

Melanoma --- Antigens --- Kidney --- Myoblasts --- Tetracycline