Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Therapeutics --- utilization --- Therapeutics --- utilization

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

AGED, THERAPEUTICS --- AGED, THERAPEUTICS

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Robotics --- Therapeutics

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Nanoparticles --- Neoplasms --- Therapeutics

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De stress-respons bestaat uit twee belangrijke componenten, namelijk de hypothalamus-hypofysaire-adrenale as en het autonome zenuwstelsel. Na activatie van deze twee componenten worden zowel glucocorticoïden als (nor-) adrenaline aangemaakt die aan de basis liggen van de zogenaamde vecht-en-vlucht reacties. In deze thesis werd de werking van deze twee systemen in de hypofysevoorkwab van ratten bestudeerd en tonen we de expressie aan van twee G-proteïne gekoppelde receptoren, de ß1-adrenerge receptor (ß1-AR) en de glucocorticoïd-geïnduceerde receptor (GIR), die beiden gereguleerd worden door glucocorticoïden. Het mRNA van deze beide receptoren zakt naar een laag niveau door de cellen in aggregaatcelcultuur te brengen en wordt er door dexamethasone (DEX) op een dosis- zowel als een tijdsafhankelijke manier opgereguleerd. Ook de ß2-AR wordt opgereguleerd maar duidelijk veel minder en met een andere dosis-effect relatie. Glucocorticoïden verhinderen eveneens de afname van ß1-AR mRNA in cultuur. Naast het mRNA komt ook het ß1-AR eiwit voor in de hypofyse maar vertoont een zwakkere opregulering door DEX. Na afzondering van twee subpopulaties hypofysecellen, de ene verrijkt in kleine, voornamelijk lactotrope en folliculo-stellate cellen, de andere in grote, somatotrope en gonadotrope cellen, werd de sterke toename van ß1-AR mRNA door DEX in de eerste celpopulatie teruggevonden maar niet in de populatie met grote gonadotrope en somatotrope cellen. Door middel van confocale immunofluorescentiemicroscopie toonden we ß1-AR-immuunreactiviteit aan in gonadotrope cellen en vooral in die gonadotrope cellen die omringd worden door zogenaamde ‘schaalvormige’ lactotrope cellen. Er werd echter geen immuunreactie voor ß1-AR teruggevonden in somatotrope, lactotrope, corticotrope, thyrotrope en folliculo-stellate cellen. De selectieve localisatie in gonadotrope cellen werd bevestigd met behulp van kwantitatieve RT-PCR en immunoblot analyse op mRNA- en proteïne-extracten van cellijnen afgeleid van de hypofysevoorkwab. Relatief hoge ß1-AR expressie werd waargenomen in de αT3-1 (gonadotrope precursor) en LßT2 (gonadotrope cellijn die LH exprimeert) cellijn in vergelijking met de veel lagere waarden in de GHFT (somatotrope precursor), TtT/GF (folliculo-stellate) en GH3 (lactosomatotrope) cellijn. Al deze cellijnen brengen ook ß1-AR mRNA tot expressie behalve de GH3 cellijn. De ß-AR agonist isoproterenol stimuleerde de productie van cAMP in hypofyseaggregaatculturen, alsook in de TtT/GF, GHFT, αT3-1 en LßT2 cellijn maar niet in GH3 cellen. Verder konden we aantonen door middel van de ß2-AR selectieve antagonist ICI 118,551 en de ß1-AR selectieve antagonisten CGP 20712A en ICI 89,406 derivaat 8a dat isoproterenol-gestimuleerde cAMP productie niet gemediëerd werd door de ß1-AR in GHFT en TtT/GF cellen terwijl dit wel het geval was in hypofyseaggregaten en de gonadotrope cellijnen αT3-1 en LßT2. In de hormonale cellijnen bleken deze responsen onafhankelijk te zijn van gluocortioïden terwijl ß1-AR-gemediëerde cAMP productie in TtT/GF cellen op een DEX-afhankelijke manier plaatsvond. Dit effect werd echter alleen waargenomen bij zeer hoge concentraties van noradrenaline en de productie van cAMP door isoproterenol werd niet verminderd door ß1-AR blokkering met behulp van CGP 20712A. We besluiten dan ook dat de ß1-AR tot expressie komt in een subpopulatie van gonadotrope cellen, die een speciale topografische relatie hebben met lactotrope cellen en onafhankelijk zijn van glucocortioïden. De DEX-afhankelijke regulatie van ß1-AR mRNA is naar alle waarschijnlijkheid niet gelokaliseerd in een specifiek celtype maar lijkt eerder het resultaat te zijn van paracriene interacties tussen verschillende cellen waaronder niet-hormonale cellen (mogelijk folliculo-stelate cellen). In aggregaatculturen van hypofysecellen, maar niet in de cellijnen, inhibeert CGP 20712A de basale productie van cAMP. Deze inhibitie van cAMP werd niet waargenomen met andere ß-AR antagonisten zoals propranolol, betaxolol, ICI 89,406 derivaat 5a en carvedilol. Het feit dat het effect van CGP 20712A geblokkeerd werd door carvedilol, welke werkt als een neutrale antagonist, en door behandeling met pertussis toxine (PTx) suggereert dat ß1-adrenerge receptoren in de hypofysevoorkwab constitutieve activiteit vertonen en op een PTx-gevoelige manier gekoppeld zijn aan het adenylaat cyclase-systeem en dat CGP 20712A hierop inwerkt als een inverse agonist. Wanneer we door voorbehandeling met reserpine de opslag van noradrenaline uitputten, werd het effect van CGP 210712A op de basale cAMP productie verminderd. Op zichzelf deed reserpine de basale cAMP productie eveneens dalen. Wij achten het dan ook mogelijk dat (een deel van) het effect van CGP 20712A op basale cAMP veroorzaakt wordt door het verhinderen van de werking van een endogene adrenerge agonist die zorgt voor een continue productie van cAMP onder basale omstandigheden in een autocriene of paracriene terugkoppelingslus. In deze thesis werd de expressie, specifieke localisatie en activiteit van de ß1-AR aangetoond in de hypofyse van de rat en werd een glucocorticoïden-afhankelijke sturing aan het licht gebracht die in cellijnen van dit weefsel verloren is gegaan en wellicht te maken heeft met het complexe paracriene netwerk in dit weefsel. The two major effectors of the stress-response system are the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and the autonomous nervous system that upon activation result in increased glucocorticoid and (nor)epinephrine production which are the driving forces for the so-called fight-or-flight reactions. In the present study we focussed on the action of these two signalling systems in the rat anterior pituitary and report the expression of the ß1-adrenergic receptor (ß1-AR) and the glucocorticoid-induced receptor (GIR), two G-protein-coupled receptors that are target genes of glucocorticoids. Messenger RNA of both receptors was maintained at low level in cell aggregate cultures and ß1-AR mRNA was strongly up-regulated in a dose- and time-dependent manner by dexamethasone (DEX). The response characteristics were different from that of the ß2-AR. Glucocorticoids also prevented down-regulation of ß1-AR mRNA levels. The ß1-AR protein, as detected by immunoblot, was up-regulated by DEX as well in cultured aggregates. DEX-dependent up-regulation of ß1-AR was found in a separated subpopulation consisting of small-sized cells enriched in lactotrophs and folliculo-stellate cells but not in a population containing large gonadotrophs and somatotrophs. As examined by immunofluorescence confocal microscopy, ß1-AR-immunoreactivity (-ir) was detected in gonadotrophs but not in somatotrophs, lactotrophs, corticotrophs, thyrotrophs or folliculo-stellate cells. Remarkably, ß1-AR-ir cells were often surrounded by cup-shaped lactotrophs. The selective localization in gonadotrophs was confirmed by quantitative RT-PCR and immunoblot analysis on mRNA- and protein-extracts of anterior pituitary cell lines showing that ß1-AR is more abundantly expressed in αT3-1 (gonadotroph precursor) and LßT2 (LH gonadotroph) cells compared to GHFT (somatotroph precursor), GH3 (lactosomatotroph) and TtT/GF (folliculo-stellate) cells. All these cell lines, except GH3 cells, expressed ß2-AR mRNA as well, but without large differences in expression level. The ß-AR agonist isoproterenol stimulated cAMP levels in pituitary aggregate cell cultures, GHFT, αT3-1, LßT2 and in TtT/GF cells but not in GH3 cells. As studied with the selective ß1-AR antagonists CGP 20712A and ICI 89,406 derivative 8a and the selective ß2-AR antagonist ICI 118,551, isoproterenol-induced cAMP levels were not mediated by ß1-ARs in GHFT and TtT/GF cells whereas in aggregates and in both gonadotroph cell lines, i.e. αT3-1 and LßT2, the ß1- and ß2-AR antagonists each blocked the response. Responses were glucocorticoid-independent in the hormonal cell lines but ß1-AR-mediated cAMP stimulation was DEX-dependent in TtT/GF cells. This response was only seen with very high doses of norepinephrine and not after ß1-AR blockade of isoproterenol-stimulated cAMP accumulation with CGP 20712A. Taken these data together we propose that the ß1-AR is expressed in a subpopulation of gonadotrophs with a special topographic relationship to lactotrophs in a DEX-independent way but that the DEX-dependent regulation of ß1-AR mRNA is likely not located in a specific cell type but is the consequence of paracrine interactions with non-hormonal cells (possibly folliculo-stellate cells). In cultured anterior pituitary cell aggregates, but not in cell lines, CGP 20712A inhibits basal cAMP levels, an effect not seen with other ß-AR antagonists such as propranolol, betaxolol, ICI 89,406 derivative 5a or carvedilol which was described as a neutral ß1-AR antagonist. The effect was blocked by carvedilol and by pre-treatment with pertussis toxin (PTx), suggesting that ß1-ARs in the anterior pituitary are constitutively active and coupled to the adenylate cyclase system in a PTx-sensitive manner, on which CGP 20712A would act as an inverse agonist. Depletion of stored norepinephrine from secretory vesicles by pre-treatment of aggregates with reserpine blocked the inhibition of basal cAMP levels by CGP 20712A as well and caused an inhibition of basal cAMP accumulation by itself. Therefore, (part of) the effect of CGP 20712A might be based on interruption of an endogenous adrenergic agent tonically elevating basal cAMP accumulation in an autocrine/paracrine loop. The present work has revealed the expression, cellular localization and activity of the ß1-AR in the rat pituitary and has shown a glucocorticoid-dependent drive that is lost in pituitary cell lines. This ß1-AR system may be involved in the complex paracrine network acting in this tissue.

Academic collection --- 615 --- Pharmacology. Therapeutics. Toxicology --- Theses