Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

he mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) generates most of the cellular energy in the form of ATP. Pathogenic variants in genes crucial for mitochondrial function cause primary mitochondrial diseases (PMD). PMD form a large, heterogeneous group of disorders that affect at least 1 in 5000 individuals. Patients may present at any age, with symptoms in any organ, at any severity. Due to the diversity in clinical presentation and the lack of a single clear biochemical profile, diagnosis of PMD remains a challenge. Most PMD have a poor prognosis and lack effective therapies. There is thus a need for the development of specific, sensitive and rapid diagnostic markers, and for the discovery of effective therapeutic interventions.We hypothesised that PMD causes important metabolic changes due to the key role of mitochondria in numerous biochemical pathways. This project aimed to understand the cellular metabolic re-wiring occurring in PMD by characterising the metabolic consequences of OXPHOS dysfunction in skin fibroblasts derived from patients with PMD and healthy controls. The objectives were 3-fold: first to develop a new diagnostic technique, second to unravel the cellular profile in OXPHOS dysfunction, and third, to identify and test novel treatment strategies. First, the potential of oxygraphy as a diagnostic tool for PMD was investigated and compared to the gold standard of enzymology. The results showed that oxygraphy is a powerful new tool for the biochemical detection of PMD. However, oxygraphy and enzymology are complementary techniques, and should ideally be combined. The biochemical results must also be interpreted in regard to the clinical presentation, the other investigations already performed, and genetic testing results. Second, the metabolic profile of OXPHOS dysfunction was described in skin-derived fibroblasts obtained from patients with diverse PMD and validated in pharmacological models of OXPHOS dysfunction. Growth rate was determined using the Incucyte technology and steady-state glucose and glutamine tracing studies were performed with LC-MS quantification of cellular metabolites. Our results revealed that OXPHOS deficiency causes a proliferation defect and is associated with a distinct metabolic profile. The main features of this signature are a depletion of aspartic acid, of TCA intermediates and increased levels of glycerol-3-phosphate. This profile seems to be related to an NAD+/NADH imbalance. Finally, the therapeutic potential of numerous nutritional supplements was tested by assessing their effect on proliferation and on the metabolomics profile. In fibroblasts, therapy with pyruvate and uridine rescued the metabolic signature of OXPHOS dysfunction and the subsequent proliferation defect. Additionally, in zebrafish, pyruvate and uridine treatment increased the survival after rotenone exposure. This project highlights the importance of the NAD+/NADH imbalance following OXPHOS dysfunction and opens the door to novel diagnostic techniques and therapeutic interventions for PMD.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

ABSTRACT Background and objectives: Hypophosphatasia (HPP) is a rare disorder caused by mutations in the alkaline phosphatase (ALP) gene, and characterized by low ALP levels and musculoskeletal, dental and systemic manifestations. Awareness of the diagnosis is important e.g. to avoid inappropriate treatment. Here we describe a case series of HPP patients known at the University Hospitals of Leuven. Secondly, we investigated the feasibility and the ethical aspects of a case finding strategy. Methods: Patients with HPP were identified through medical record review. Inclusion criteria were: 1) age ≥ 16 years; 2) low serum ALP level not explained by secondary causes; 3) one or more of the following additional supporting elements: biochemical evidence of elevated enzyme substrates; subtrochanteric fractures, metatarsal fractures or other typical clinical features; family history of HPP; or genetic testing positive for a known HPP mutation. Secondly, the laboratory database of our hospital was searched for patients within the Internal Medicine department with persistently low serum ALP levels. Results: 18 patients met our inclusion criteria. Fractures and dental abnormalities were the most reported symptoms. Fatigue was reported in 7 patients (39%), 3 of which had been previously categorized as having chronic fatigue syndrome. Seven patients (39%) were inappropriately treated or planned to be treated with antiresorptive treatment. Patients detected by family screening were less severely affected, while patients with homozygous or compound heterozygous mutations had the most severe symptoms, significantly lower serum ALP levels and higher substrate levels. In the laboratory database, the prevalence of a persistently low serum ALP level was 0.1%. Detailed medical record review found no secondary causes of persistently low ALP values in a subgroup of 100/190 patients (52.6%). Conclusion: Our case series helps to understand the spectrum of HPP disease severity. Since disease recognition is low in HPP, a case finding strategy based on low serum ALP levels can be defended. Further research into the prevalence of HPP and the risks of case finding is required.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De lever is het grootste interne orgaan van het menselijk lichaam en speelt een centrale rol in de synthese van proteïnen en in het metabolisme. Bijgevolg vormen parenchymale levercellen (i.e. hepatocyten) een uitgelezen doelwit voor therapeutische strategieën gericht op modulatie van het lipoproteïnemetabolisme en andere risicofactoren bij preventie van cardiovasculaire aandoeningen, alsook strategieën gericht op de genetische correctie van aangeboren aandoeningen van het metabolisme en van hemofilie. Het coherente doel van dit doctoraatsonderzoek is de ontwikkeling van krachtigere en veiligere hepatocyt-specifieke gentransfertechnologieën en de applicatie van deze technieken binnen de context van in vivo studies gericht op het beantwoorden van specifieke experimentele vraagstellingen. Voorgaande studies van onze onderzoeksgroep toonden aan dat de diameter van sinusoïdale fenestrae een kritische determinant is van species- en stamverschillen in hepatocyttransductie na adenovirale gentransfer. In hoofdstuk IV.1 werd getracht deze bevindingen uit te breiden en toonden wij aan dat de diameter van sinusoïdale fenestrae in gezonde humane leverbiopten (107 ± 1.5 nm) vergelijkbaar is met de diameter waargenomen in Nieuw Zeeland Witte konijnen (103 ± 1.3 nm), hetgeen beduidend kleiner is dan in C57BL/6 muizen (141 ± 5.4 nm) en Sprague Dawley ratten (161 ± 2.7 nm). Om directe effecten van de diameter van sinusoïdale fenestrae op hepatocyttransductie te evalueren in de afwezigheid van ‘confounding’ genetische factoren, werd de diameter van sinusoïdale fenestrae bepaald in een substam van Nieuw Zeeland Witte konijnen, welke gekenmerkt werd door significant hogere transgenexpressieniveaus na adenovirale gentransfer. De diameter van sinusoïdale fenestrae in deze konijnen was significant hoger dan in Nieuw Zeeland Witte controlekonijnen (113 ± 1.5 nm), consistent met onze a priori hypothese. Afsluitend toonden in vitro filtratieëxperimenten, gebruikmakend van polycarbonaatfilters met poriën van gekende grootte, aan dat een relatief kleine toename van de diameter van fenestrae de passage van adenovirale vectoren significant kan beïnvloeden. Gebaseerd op voorgaande experimentele resultaten bekomen in muizen, ratten en drie verschillende konijnenstammen, voorspellen deze data een lage transductie van humane hepatocyten door adenovirale vectoren in vivo. Bijgevolg dient de kleinere diameter van humane sinusoïdale fenestrae in acht genomen te worden bij de ontwikkeling van virale en niet-virale gentransfer. De aanwezigheid van grotere fenestrae in muizen en ratten limiteert de externe validiteit van data bekomen in preklinische modellen in deze knaagdieren. Optimalisatie van transcriptionele sequenties is één van de meest robuuste manieren om de therapeutische index van verschillende vectorsystemen te verhogen. In hoofdstuk IV.2 van dit manuscript werd aangetoond dat de DC172 promotor, bestaande uit een 890 bp humane α1-antitrypsine promotor en 2 kopijen van de α1-microglobuline enhancer, gecombineerd met 2 kopijen van de 774 bp hepatic control region-1 de meest krachtige expressiecassette vormt voor hepatocyt-specifieke gentransfer, zowel in het kader van adenovirale gentransfer als voor hydrodynamische gentransfer van plasmide DNA. In vergelijking met ons referentieconstruct, bestaande uit een 1.5 kb humane α1-antitrypsine promotor en 4 kopijen van de humane apo E enhancer, resulteerde deze expressiecassette in een 1.7-voudige (p<0.01) en 2.9-voudige (p<0.01) stijging van de piekexpressieniveaus na respectievelijk hydrodynamische gentransfer van plasmide DNA en na adenovirale gentransfer. Eén van de limiterende factoren voor het gebruik van plasmide DNA als niet-virale vector is de transcriptionele silencing van transgenexpressie in vivo, welke veroorzaakt wordt door bacteriële sequenties die covalent gebonden zijn aan de expressiecassette in cis. Minicirkels, welke ontdaan zijn van bacteriële sequenties, kunnen mogelijk persisterende transgenexpressie induceren. Onze experimenten toonden aan dat inclusie van de meest krachtige expressiecassette in een minicirkel ruggengraat resulteert in persisterende en fysiologische expressieniveaus van meerdere transgenen in C57BL/6 muizen tot 3 maanden na hydrodynamische gentransfer. Aangezien minicirkels onder episomale vorm in de nucleus verblijven, gaat het DNA verloren tijdens mitose wanneer de nucleaire enveloppe afgebroken wordt. Om deze reden werd geëvalueerd of episomale replicatie van minicirkels bekomen kan worden door inclusie van de humane ‘scaffold matrix attachment region’ uit de 5’ regio van het humane interferon β gen samen met een SV40 oorsprong van replicatie. Episomale replicatie werd geëvalueerd door een 70% partiële hepatectomie op dag 6 na hydrodynamische gentransfer. De drastische daling van transgenexpressie en transgen DNA kopijaantallen in de lever na hepatectomie geeft aan dat deze minicirkels niet episomaal replicatief zijn. In tegenstelling tot voorgaande hoofdstukken, welke gericht waren op de biotechnologische aspecten van gentransfer, omvat het tweede deel van dit onderzoek functionele cardiovasculaire studies met als doel het beantwoorden van specifieke biologische vraagstellingen. Niettegenstaande de significante vooruitgang die bekomen werd op het vlak van niet-virale gentransfer, blijft de algehele efficiënte significant lager in vergelijking tot de overeenkomstige adenovirale vectoren. Bijgevolg werden in toegepaste interventiestudies gebruik gemaakt van beschikbare adenovirale gentransfertechnologieën. In hoofdstuk IV.3 van deze Ph.D. thesis werden studies uitgevoerd in een muismodel van familiale hypercholesterolemie om effecten na te gaan van het moduleren van plasma cholesterolniveaus op de cholesterolhomeostase in vasculaire en niet-vasculaire organen. Overmatig cholesterol wordt voornamelijk geklaard uit het plasma door expressie van de LDLr, welke pro-atherogene apo B-bevattende lipoproteïnen bindt. Anderzijds kan expressie van de VLDLr, een paraloog van de LDLr welke normaliter niet tot expressie wordt gebracht door hepatocyten, fungeren als een back-up strategie aangezien de LDLr in deze dieren gedetecteerd kan worden als een neo-antigen en als dusdanig een adaptieve immuunrespons kan induceren. Dit vormt de rationale voor hepatocyt-specifieke gentransfer van de LDLr en de VLDLr als een behandeling voor familiale hypercholesterolemie. Vanaf de leeftijd van 12 weken werden LDLr deficiënte muizen gedurende 3 tot 6 maanden geplaatst op een standaarddieet of een atherogeen dieet aangerijkt met 0.2% (w/w) cholesterol en 10% (v/w) kokosnootolie. Drie weken na initiatie van het dieet werden deze muizen geïnjecteerd met de adenovirale controlevector Adnull, welke geen expressiecassette bevat, of adenovirale vectoren met een hepatocyt-specifieke expressiecassette voor overexpressie van de LDLr (AdLDLr) en de VLDLr (AdVLDLr). Ultracentrifugatie van lipoproteïnen gaf aan dat AdLDLr en AdVLDLr resulteerden in een significante en persisterende daling van VLDL-, IDL- en LDL-cholesterol, zonder een effect op HDL-cholesterolniveaus. Deze reductie van pro-atherogene lipoproteïnen na LDLr en VLDLr gentransfer resulteerde in een significante reductie van de graad van atherosclerose in de opstijgende aorta in beide geslachten. Regressieanalyse toonde bijkomend aan dat vrouwelijke LDLr deficiënte muizen sterker onderhevig zijn aan de ontwikkeling van atherosclerose in vergelijking met mannelijke muizen, of anders gesteld, dat de atherogeniciteit van niet-HDL partikels hoger is in vrouwelijke muizen. Tenslotte gaven kwantificaties van cholesterolgehaltes in de lever aan dat er geen accumulatie is van overmatig cholesterol op 3 maanden en 6 maanden na AdLDLr gentransfer, hetgeen indicatief is dat de afwezigheid van fysiologische regulatie van LDLr expressie geen obstakel vormt voor de ontwikkeling van gentransfer voor de behandeling van familiale hypercholesterolemie. In overeenstemming hiermee werd een significante toename van de vrije cholesterolinhoud in het myocard, de musculus quadriceps en de nier waargenomen in mannelijke en vrouwelijke controlemuizen, terwijl vrije cholesterolgehaltes in AdLDLr gentransfermuizen niet verschilden van basislijnwaarden. Er werden geen effecten geobserveerd van dieet noch gentransfer op cholesterolgehaltes in de hersenen. Ondanks een pleiade aan epidemiologische studies welke een mogelijk mechanistisch verband suggereren tussen hyperhomocysteïnemie en de ontwikkeling van cardiovasculaire aandoeningen, resulteerden klinische trials in controversiële resultaten. Bijgevolg is een kritische herevaluatie van de rol van homocysteïne als cardiovasculaire risicofactor binnen een experimentele context aangewezen. In hoofdstuk IV.4 van dit project, werden de effecten geanalyseerd van een selectieve verlaging van homocysteïne of apo B-bevattende lipoproteïnen in een muismodel van gecombineerde hyperhomocysteïnemie en hypercholesterolemie. LDLr deficiënte muizen werden gekruist met muizen deficiënt voor cystathionine-β-synthase (CBS), het snelheidsbepalende enzym in de afbraak van overmatig homocysteïne. Heterozygote deficiëntie van CBS resulteert in een verdubbeling van de plasma homocysteïnespiegels en leidt tot een significant verhoogde gevoeligheid aan dieet-geïnduceerde hyperhomocysteïnemie. Om pathologisch relevante graden van hyperhomocysteïnemie en hypercholesterolemie te induceren, werden mannelijke LDLr deficiënte muizen en mannelijke LDLr deficiënte muizen met een heterozygote deficiëntie voor CBS gedurende 9 weken geplaatst op een foliumzuur-arm (0.2 mg/kg), methionine-rijk (4.1 g/kg) dieet aangerijkt met 0.2% (w/w) cholesterol en 10% (v/w) kokosnootolie. Geen verschillen in plasma cholesterolgehaltes werden gedetecteerd tussen mannelijke LDLr deficiënte muizen en mannelijke LDLr deficiënte muizen met een heterozygote deficiëntie voor CBS op dieet. In vergelijking met mannelijke LDLr deficiënte muizen, waren plasma homocysteïnespiegels echter 3.4-voudig verhoogd in mannelijke LDLr deficiënte CBS heterozygoot deficiënte muizen (24 ± 2.7 µmol/l versus 82 ± 14 µmol/l; p<0.01). Maximale vasorelaxatie van thoracale aorta’s in respons op de endotheel-afhankelijke vasodilator acetylcholine was ernstig verstoord in mannelijke LDLr deficiënte CBS heterozygoot deficiënte muizen maar niet in mannelijke LDLr deficiënte controlemuizen (61 ± 6.5% versus 98 ± 2.7%; p<0.001). Gebaseerd op de vooruitgang in het ontwerp van expressiecassettes voor levergerichte gentransfer, werden nieuwe adenovirale vectoren geconstrueerd voor hepatocyt-specifieke overexpressie van de LDLr of CBS (AdDC172.LDLr en AdCBS, respectievelijk). Drie weken na initiatie van het dieet werden mannelijke LDLr deficiënte CBS heterozygoot deficiënte muizen geïnjecteerd met AdDC172.LDLr en AdCBS. Alhoewel gentransfer met AdDC172.LDLr plasmaspiegels van van apo B-bevattende lipoproteïnen meer dan 16-voudig (p<0.0001) verlaagde, resulteerde dit niet in een verbetering van de endotheelfunctie in mannelijke LDLr deficiënte CBS heterozygoot deficiënte muizen (maximale vasorelaxatie: 65 ± 5.8%). Gentransfer met AdCBS, welke plasma homocysteïnespiegels normaliseert, resulteerde echter in een volledig herstel van de endotheelfunctie in mannelijke LDLr deficiënte CBS heterozygoot deficiënte muizen in vergelijking tot mannelijke LDLr deficiënte controlemuizen. De data in deze doctoraatsthesis stellen de limitaties van de huidige hepatocyte-gerichte adenovirale gentransfermodaliteiten met het oog op klinische translatie verder in het licht. De kleine diameter van sinusoïdale fenestrae in mensen vormt hierin mogelijks een onoverkomelijke hindernis. Anderzijds resulteert bovenstaande technologische vooruitgang, zoals bevestigd wordt door de ontwikkeling van krachtige expressiecassettes beschreven in deze thesis, in de vorming van een extreem krachtig onderzoeksmiddel voor toegepaste biologische studies in knaagdieren. De veelzijdigheid van experimentele ontwerpen die gebruik maken van gentransfervectoren vormt tevens een solide basis om nieuwe hypothesen te onderzoeken welke ontspringen uit bovenstaande experimenten. The liver is the largest internal organ of the human body and plays a central role in protein synthesis and metabolism. Therefore, parenchymal liver cells (i.e. hepatocytes) constitute a key target for therapeutic strategies aimed at modulation of the lipoprotein metabolism and other cardiovascular risk factors, as well as correction of inborn errors of metabolism and of hemophilia. The coherent goal of this Ph.D. thesis is the development of more potent and safe hepatocyte-specific gene transfer technologies and the application of these technologies within an experimental in vivo setting as a means to address specific biological queries. Previous studies from our group have indicated that the diameter of sinusoidal fenestrae is a key determinant of species and strain differences in hepatocyte transduction following adenoviral gene transfer. In chapter IV.1, we elaborated these findings and demonstrated that the diameter of sinusoidal fenestrae in healthy human livers (107 ± 1.5 nm) is comparable to the diameter observed in New Zealand White rabbits (103 ± 1.3 nm) and is significantly smaller compared to the diameter in C57BL/6 mice (141 ± 5.4 nm) and Sprague Dawley rats (161 ± 2.7 nm). To assess the effects of the diameter of sinusoidal fenestrae on hepatocyte transduction in the absence of genetic confounding factors, we evaluated the diameter of sinusoidal fenestrae in a substrain of New Zealand White rabbits characterized by significantly higher levels of transgene expression following adenoviral gene transfer. The diameter of sinusoidal fenestrae in this substrain was significantly higher (113 ± 1.5 nm) compared to control New Zealand White rabbits, consistent with our a priori hypothesis. Finally, in vitro filtration experiments using polycarbonate filter membranes with pores of known sizes suggest that a relatively small increase in the diameter of fenestrae may significantly affect passage of adenoviral vectors. Based on prior experimental results in mice, rats, and three different strains of rabbits, these data predict poor transduction of human hepatocytes by adenoviral vectors in vivo. Taken together, the small size of human sinusoidal fenestrae should be taken into account in the development of viral and non-viral hepatocyte-directed gene transfer. The presence of large fenestrae in mice and rats limits the external validity of data obtained in preclinical models in these rodents. Optimalization of transcriptional sequences is one of the most robust ways to improve the therapeutic index of different gene transfer vector systems. In chapter IV.2 of this manuscript, we showed that the combination of the DC172 promoter, consisting of an 890 bp human α1-antitrypsin promoter and 2 copies of the α1-microglobulin enhancer, combined with 2 copies of the 774 bp hepatic control region-1, is the most potent expression cassette for hepatocyte-specific gene transfer, both in the setting of adenoviral gene transfer as for hydrodynamic gene transfer of plasmid DNA. Compared to our reference construct consisting of a 1.5 kb human α1-antitrypsin promoter and 4 copies of the human apo E enhancer, this expression cassette resulted in a 1.7-fold (p<0.01) and a 2.9-fold (p<0.01) increase of peak expression levels following hydrodynamic gene transfer of plasmid DNA and following adenoviral gene transfer, respectively. A major limiting factor in the use of plasmid DNA as a non-viral gene transfer vector is the transcriptional silencing of transgene expression in vivo, caused by bacterial sequences covalently linked to the expression cassette in cis. Minicircle vectors, which are devoid of bacterial sequences, may induce persistent transgene expression. Here, we showed that inclusion of the most potent expression cassettes into a minicircle backbone, results in persistent and physiological levels of multiple transgenes for up to 3 months following hydrodynamic gene transfer in C57BL/6 mice. Since minicircle DNA resides within the nucleus in an episomal form, transgene DNA is lost during mitosis when the nuclear envolope is broken down. Presence of the human ‘scaffold matrix attachment region’ from the 5’ region of the human interferon β gene and an SV40 origin of replication within these minicircles may confer episomal replication. Episomal replication was evaluated by a 70% partial hepatectomy at day 6 after gene transfer. The drastic decline in transgene expression levels and transgene DNA copy numbers in the liver following hepatectomy indicates that these minicircles are not episomally replicative. Whereas chapters IV.1 and IV.2 were aimed at biotechnological aspects of gene transfer, the second part of this manuscript entailed functional cardiovascular studies to evaluate specific biological queries. Notwithstanding significant progress obtained in the development of non-viral gene transfer modalities, overall efficiency remains significantly lower compared to the corresponding adenoviral vectors. Therefore, applied intervention studies were performed using available adenoviral gene transfer technologies. In chapter IV.3 of this Ph.D. thesis, intervention studies were conducted in a murine model of familial hypercholesterolemia to assess the effects of modulation of plasma cholesterol levels on cholesterol homeostasis in vascular and non-vascular organs. Excess cholesterol is predominantly cleared from the plasma by expression of the LDLr in hepatocytes, which binds pro-atherogenic apo B-containing lipoproteins. Alternatively, expression of the VLDLr, a paralogue of the LDLr which is normally not expressed by hepatocytes, may serve as a back-up mechanism, since it is possible that the LDLr can be detected as a

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De voorbije decennia werd een enorme vooruitgang geboekt in de transplantatiegeneeskunde. Niertransplantatie is hierdoor uitgegroeid tot de eerste-keuze behandeling van eind-stadium nierlijden. Hoewel het gebruik van combinaties van nieuwe en krachtige geneesmiddelen om afstoting te voorkomen (immuunsuppressiva) geleid heeft tot excellente resultaten vroegtijdig na transplantatie, zowel wat betreft patiënt- als nieroverleving, vindt dit onvoldoende weerspiegeling op lange termijn. De belangrijkste oorzaak voor dit laattijdig verlies van transplantnieren is een traag progressieve microscopische (histologische) beschadiging van de transplantnieren. Enerzijds wordt deze histologische beschadiging van transplantnieren veroorzaakt door chronische afstoting, maar anderzijds ook door toxiciteit ten gevolge van het langdurig gebruik van de immuunsuppressiva. De meest frequent gebruikte combinatietherapie vandaag is een combinatie van corticosteroïden, een calcineurine inhibitor (cyclosporine of tacrolimus) en mycofenolaat. Het is inderdaad zo dat immuunsuppressiva maar uiterst zelden in monotherapie voorgeschreven worden. In de meeste gevallen worden 2 tot 4 immuunsuppressiva gecombineerd om maximaal effect te bekomen met zo laag mogelijke dosis en daardoor meer verspreide toxiciteit. Desondanks blijft toxiciteit van de immuunsuppressiva een groot probleem, waarbij vooral lokale toxiciteit van cyclosporine en tacrolimus in de transplantnieren de resultaten op lange termijn hypothekeert. Tenslotte, naast de gevolgen van afstoting en toxiciteit, wordt het functioneren en de levensduur van de nieren na transplantatie in belangrijke mate bepaald door de kwalitieit van de donornieren. Door de schaarste aan donor-organen worden steeds meer nieren van mindere kwaliteit getransplanteerd, afkomstig van oudere donoren of donoren met voorafbestaande maar vaak niet gekende comorbiditeit als hypertensie, diabetes of cardiovasculaire problemen. Het blijft een moeilijke oefening om een evenwicht te vinden tussen het maximaal voorkomen van afstoting enerzijds en een zo laag mogelijk risico op nevenwerkingen van de immuunsuppressiva anderzijds. Om de juiste balans te vinden kan de graad van immuunsuppressie rechtstreeks gemeten worden, maar op dit ogenblik zijn deze technieken in ontwikkeling en nog niet klinisch toepasbaar. Een meer onrechtstreekse methode voor opvolging van de graad van immuunsuppressie is het meten van de bloedspiegels van de gebruikte immuunsuppressiva, wat daarenboven het voordeel heeft dat ook toxische spiegels gemeten kunnen worden. Vooral voor cyclosporine en tacrolimus is het opvolgen van de bloedspiegels en aanpassen van de dosis aan de spiegels routine klinische praktijk geworden. Hierdoor is de farmacokinetiek –de opname, distributie, afbraak en uitscheiding van de medicatie door het lichaam– goed gekend voor cyclosporine en tacrolimus, alsook de interacties die voorkomen met andere geneesmiddelen en zelfs de erfelijke factoren die een rol spelen in de variatie tussen personen in de farmacokinetiek van cyclosporine en tacrolimus. Voor andere immuunsuppressiva zoals mycofenolaat worden de bloedspiegels (nog) niet routinematig opgevolgd. Hierdoor, en doordat mycofenolaat gekenmerkt wordt door een meer complexe farmacokinetiek, zijn de factoren die de farmacokinetiek van mycofenolaat beïnvloeden minder goed gekend. Recente studies hebben echter aangetoond dat een striktere opvolging van de bloedspiegels van mycofenolaat nuttig zou kunnen zijn om afstoting te voorkomen. Het is daarom belangrijk een beter inzicht te krijgen in de factoren die de farmacokinetiek van mycofenolaat beïnvloeden, zoals de interacties met andere geneesmiddelen, en de erfelijke factoren met invloed op de interindividuele variabiliteit. In het eerste deel van dit proefschrift werd ingegaan op de farmacokinetiek van mycofenolaat, en toonden we aan dat deze beïnvloed wordt door variatie in de opname (absorptie), afbraak (metabolisatie) en uitscheiding (excretie) van mycofenolaat. Hierbij beschreven we de invloed van de snelheid van maaglediging op de opnamesnelheid van mycofenolaat (Hoofdstuk 2.1), en konden we aantonen dat er een klinisch belangrijke interactie bestaat tussen rifampicine (een antibioticum vooral gebruikt in de behandeling van tuberculose) en mycofenolaat, waarbij we een gedetailleerde analyse maken van de onderliggende mechanismen. De bevindingen met rifampicine kunnen waarschijnlijk geëxtrapoleerd worden naar andere geneesmiddelen met een gelijkaardig interactieprofiel (Hoofdstuk 2.2). Ook onderzochten we de invloed van een verminderde (transplant-)nierfunctie op de bloedspiegels van mycofenolaat. Hierbij stelden we vast dat een matige nierfunctievermindering leidt tot een verminderde renale excretie van de afbraakproducten en tot opstapeling van mycofenolaat en zijn afbraakproducten in het lichaam, met potentieel een hoger risico op bijwerkingen (Hoofdstuk 2.3). Verder werd ook een duidelijke invloed van diabetes op de farmacokinetiek van mycofenolaat vastgesteld (lagere blootstelling), die niet (alleen) verklaard kan worden door een vertraagde maaglediging, zoals eerder werd gesuggereerd, maar waarschijnlijk mede veroorzaakt wordt door rechtstreekse invloeden van diabetes op de metabolisatiesnelheid van mycofenolaat. Tenslotte hebben we de invloed van frequent voorkomende genetische varianten in de genen voor UGT1A9 (belangrijk voor metabolisatie) en MRP2 (belangrijk voor excretie) op de farmacokinetiek van mycofenolaat beschreven, voor het eerst in een humane setting (Hoofdstukken 2.4 en 2.5). Naast het meten van de graad van immuunsuppressie en onrechtstreekse parameters voor effectiviteit en toxiciteit, kunnen ook surrogaat eindpunten worden gebruikt voor de klinische opvolging van transplantnierpatiënten. Aangezien het verlies van een transplantnier veelal voorafgegaan wordt door een geleidelijke vermindering van de werking van de transplantnier, vormt de evolutie van de transplantnierfunctie een goede maat voor de prognose op korte tot middellange termijn. De vermindering van de transplantnierfunctie is echter meestal een heel laattijdig fenomeen, en wordt alleen duidelijk wanneer er al uitgebreide histologische beschadiging van de transplantnier is opgetreden. Maar bij uitgebreide histologische beschadiging is het onmogelijk om de onderliggende oorzaak nog te identificeren. De behandeling komt meestal te laat omdat de beschadiging onomkeerbaar geworden is. Daarom vormt de vroegtijdige histologische evaluatie van transplantnierweefsel verkregen door het routinematig uitvoeren van punctiebiopsies van transplantnieren (“protocolbiopsies”) een meer vroegtijdige en meer gevoelige parameter voor de opvolging en het opsporen van histologische beschadiging van de transplantnieren in een vroeg stadium, wanneer behandeling nog mogelijk is. Een bijkomend voordeel van het uitvoeren van protocolbiopsies is dat ook de oorzaak van de beschadiging in vele gevallen geïdentificeerd kan worden en meer gerichte behandeling kan volgen, in tegenstelling tot wanneer biopsies worden uitgevoerd op het ogenblik van transplantnierfalen. In het tweede deel van dit proefschrift werd dieper ingegaan op de histologische evolutie van transplantnieren, bij patiënten behandeld met de krachtige combinatie van tacrolimus, mycofenolaat en corticosteroïden, al of niet met bijkomende inductietherapie. Aangezien een correct inzicht in de risicofactoren voor de ontwikkeling en progressie van een aandoening essentieel is om de behandeling ervan verder te verbeteren, werden de risicofactoren die een rol spelen in deze histologische evolutie geanalyseerd, inclusief de bloedspiegels van tacrolimus en andere factoren die een rol kunnen spelen in een verhoogde individuele gevoeligheid voor toxiciteit van tacrolimus in de transplantnier. In Hoofdstuk 3.1 toonden we aan dat klinische maar ook subklinische afstotingsverschijnselen een belangrijke rol blijven spelen in de histologische evolutie van transplantnieren, ondanks het gebruik van een van de meest krachtige combinaties van immuunsuppressiva en een snelle adequate behandeling van deze afstotingsverschijnselen. We stelden ook vast dat een goede compatibiliteit tussen de receptor en de donor belangrijk blijft om het risico op afstoting zo laag mogelijk te houden, wat recent ook bevestigd werd in grotere database-studies. Door deze bevindingen loopt nu binnen de Eurotransplant-regio een pilootproject waarbij de nadruk gelegd wordt op een goede compatibiliteit voor HLA-DR bij de toekenning van transplantnieren aan de patiënten op de wachtlijst. In Hoofdstuk 3.2 onderzochten wij de factoren die de histologische evolutie van volwassen transplantnieren verklaren, wanneer die gebruikt werden voor transplantatie in kinderen en adolescenten van 1- tot 21-jarige leeftijd. Meest opmerkelijk hierbij was dat de discrepantie tussen de grootte van de volwassen transplantnieren en kleine bloedvaten van de kinderen aanleiding geeft to een relatief tekort aan bloedvoorziening van de transplantnier en secundaire onomkeerbare histologische beschadiging, die al duidelijk was in de eerste maanden na transplantatie. Dit gaat gepaard met een functionele aanpassing van de transplantnier aan de grootte van het kind dat de nier krijgt, wat ook vroeger reeds door anderen beschreven werd. In deze studie hebben we voor het eerst aangetoond dat deze functionele aanpassing echter niet of niet volledig omkeerbaar is bij de kleinste kinderen, meest waarschijnlijk door de onomkeerbare histologische beschadiging die optreedt vroeg na transplantatie. Dit kan uiteraard belangrijke gevolgen hebben voor de werking van de transplantnieren op lange termijn. Bij uitgebreide analyse van de verhouding tussen de bloedspiegels van tacrolimus en de histologische evolutie van transplantnieren bleek dat de blootstelling aan tacrolimus geen rol speelt in de gevoeligheid voor toxiciteit in de transplantnier (Hoofdstukken 3.1, 3.2 en 3.3). In Hoofdstuk 3.3 hebben we aangetoond dat onvoldoende expressie van P-glycoproteïne in de transplantnier en genetische varianten in het gen dat codeert voor P-glycoproteïne (ABCB1) onafhankelijke risicofactoren vormen voor de toename van chronische histologische schade van een transplantnier. Dit komt meest waarschijnlijk doordat onvoldoende aanwezigheid en onvoldoende werking van P-glycoproteïne leidt tot lokale opstapeling van tacrolimus en/of zijn metabolieten, en hiermee gepaard gaande lokale toxiciteit. Deze bevinding is niet alleen van belang voor niertransplantpatiënten, maar ook voor patiënten die tacrolimus nemen voor andere indicaties. Systematische screening voor genetische varianten in het gen coderend voor P-glycoproteïne en evaluatie van de lokale expressie van P-glycoproteïne in transplantnieren zou mee kunnen bepalen welke patiënten meest voordeel hebben bij een calcineurine-vrij immuunsuppressief schema. Verder stelden we vast dat de leeftijd van de donor en de kwaliteit van de transplantnier op het ogenblik van transplantatie een grote rol spelen in de histologische en functionele evolutie van de transplantnier, zowel bij volwassen transplantnierpatiënten als bij kinderen die een volwassen transplantnier kregen. Dit is onafhankelijk van de hoger beschreven effecten van P-glycoproteïne of discrepantie in grootte tussen donor en receptor. De leeftijd van de donoren bepaalde in belangrijke mate de kwaliteit van de transplantnieren, maar bleek ook van belang voor de histologische evolutie van een transplantnier na transplantatie. Hogere leeftijd van donoren bleek belangrijk geassocieerd met chronische beschadiging van alle renale compartimenten, zowel tubulo-interstitieel (tubulaire atrofie en interstitiële fibrose), vasculair (arteriolaire hyalinose en vasculaire intimaverbreding) als glomerulair (globale glomerulosclerose). Hieruit kan geconcludeerd worden dat niet alle toename van chronische histologische letsels na transplantatie veroorzaakt wordt door transplantatie-gerelateerde fenomenen. Dit is voornamelijk relevant voor letsels zoals arteriolaire hyalinose, die typisch toegeschreven worden aan het gebruik van de calcineurine-inhibitoren cyclosporine en tacrolimus, maar in twee onafhankelijke studies toch duidelijk gerelateerd bleken aan hogere donorleeftijd (Hoofdstukken 3.2 en 3.3). Tenslotte is het blijvende verschil in de lange-termijnsoverleving tussen transplantnieren van levende en nieren van overleden donoren een mooie illustratie van het belang van de kwaliteit op het ogenblik van transplantatie. In een laatste studie, uitgewerkt in Hoofdstuk 3.4, gaan we dieper in op de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor dit verschil, door gebruik te maken van microarrays die de expressie van meer dan 38.000 gekende genen tegelijk analyseren. Voor het eerst werd bij mensen aangetoond dat de lokale expressie van complementfactoren een rol speelt in dit onderscheid tussen nieren van levende en overleden donoren, waarbij zowel verlengde koude ischemietijd als hersendood bij de donor onafhankelijk van elkaar de expressie van deze complementfactoren beïnvloeden. Ook na transplantatie blijft de regeling van de lokale renale expressie van complement genen klinisch belangrijk, onafhankelijk van het feit of de nier afkomstig is van een levende of een overleden donor. Zoals reeds werd aangetoond in dierexperimenten, zou specifieke complement-inhibitie een belangrijke rol kunnen spelen in de verdere verbetering van de resultaten van niertransplantatatie. Conclusies 1. Farmacokinetiek en farmacogenetica van mycofenolaat a. Vertraagde maaglediging is geassocieerd aan een tragere absorptie van mycofenolaat, evenwel zonder invloed op de totale blootstelling (AUC0-12) aan mycofenolaat. b. Er is een significante interactie tussen mycofenolaat en rifampicine, waarbij behandeling met rifampicine leidt tot een duidelijke daling in de blootstelling aan mycofenolaat en een stijging van de bloedspiegels van de metabolieten van mycofenolaat. c. Er is een dualiteit in de effecten van nierfunctie op de farmacokinetiek van mycofenolaat. Enerzijds leidt een matige nierfunctiebeperking tot accumulatie van mycofenolaat en zijn metabolieten en tot een secundair verhoogde blootstelling, terwijl anderzijds een extreem slechte nierfunctie tot een gedaalde blootstelling leidt door een verhoogde vrije fractie en secundair verhoogde metabolisatie. d. Diabetes mellitus is geassocieerd aan een gedaalde blootstelling aan mycofenolaat. Dit kan niet volledig verklaard worden door vertraagde maaglediging, maar is waarschijnlijk mede veroorzaakt door effecten van diabetes mellitus op de metabolisatie van mycofenolaat. e. Frequent voorkomende genetische varianten in UGT1A9 en ABCC2 genen hebben een significante invloed op de farmacokinetiek van mycofenolaat. 2. Histologische en klinische evolutie van een transplantnier a. T-cel-gemedieerde afstoting van de transplantnier blijft de belangrijkste oorzaak van vroegtijdige vermindering van transplantnierfunctie en transplantnieroverleving, ondanks het gebruik van krachtige immuunsuppressieve combinatietherapie. b. Het aantal HLA-DR mismatchen blijft een belangrijke risicofactor voor afstoting van een transplantnier