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Diabetes Mellitus, Type 2 --- Glucokinase --- Homeostasis

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Glucose is the main physiological stimulus of insulin secretion by pancreatic islet β-cells. In the long term, glucose also exerts complex effects on the functional β-cells mass. In vitro, rat β-cell survival and function are optimally preserved during culture in the presence of 10 mmol/l glucose (G10) and are markedly altered at either higher (30 mmol/l or G30) or lower (2 mmol/l or G2) glucose concentrations. Among genes that are affected by glucose in cultured rat islets, the mRNA levels of integrated stress response (ISR) genes follow a V-shaped profile similar to that of apoptosis, with a minimum in G10, a large increase in G2 and a moderate increase in G30. The ISR is initiated by the phosphorylation of the α subunit of eukaryotic initiation factor 2 by various types of stress, including endoplasmic reticulum stress. It is characterized by increased expression of Activating Transcription Factor 4 (ATF4)-target genes, such as the proapoptotic transcription factor Atf3 and its potential target Growth arrest- and DNA damage-inducible gene 153 (Gadd153). The aim of this work was to test the role of Atf3 in the induction of mouse islet cell apoptosis during prolonged culture in low and high vs intermediate glucose concentrations.
As in rat islets, culture of wild-type (WT) mouse islets in G2 vs G10 rapidly (18h) increased Atf3 and Gadd153 to Tbp mRNA ratios (real time PCR) and later (3-7 days) induced islet cell apoptosis (caspase activation and DNA fragmentation). In contrast, culture in G30 only slightly increased the mRNA levels of ISR genes as well as islet cell apoptosis. In islets from Atf3 knockout mice (Atf3-/-), the effects of G30 vs G10 on apoptosis and ISR gene mRNA levels were not different from those in WT islets. In contrast, the level of apoptosis induced by one week culture in G2 was ~50% lower in Atf3-/- vs WT islets in 3 out of 7 experiments (mean reduction of ~25%). In parallel, the mRNA level of Gadd153 was significantly lower in Atf3-/- islets after 3 or 7 days but not 18h culture in G2. On the other hand, the increase in the mRNA levels of the antiapoptotic oxidative stress-response gene Metallothionein 1a (Mt1a) induced by culture in G2 was significantly larger in Atf3-/- vs WT islets after 18h but not after 3 or 7 days of culture.
In conclusion, the increase in Atf3 gene expression induced by culture in a low glucose concentration only slightly contributes to the stimulation of islet cell apoptosis by a mechanism that may involve a late increase in the expression of the proapoptotic gene Gadd153 or an early reduction of the expression of the antiapoptotic gene Mt1a. Le glucose est le stimulus physiologique majeur de la sécrétion d’insuline par les cellules β situées au sein des îlots pancréatiques de Langerhans. A plus long terme, il exerce également des effets complexes sur la masse fonctionnelle de ces cellules. En effet, la fonction et la survie des cellules β d’îlots de rat sont préservées de manière optimale par la culture en présence de 10 mmol/l glucose (G10) alors qu’elles sont altérées par les concentrations de glucose plus faibles et plus élevées (2 et 30 mmol/l, G2 ou G30). Parmi les gènes dont l’expression est modifiée par le glucose dans les îlots de rat, les ARNm des gènes de la réponse intégrée au stress (ISR) suivent un profil en V asymétrique semblable à celui de l’apoptose, avec un minimum en G10 et une augmentation importante en G2 et plus faible en G30. L’ISR résulte de la phosphorylation du facteur eucaryote d’initiation de la traduction eIF2α par différents types de stress, y compris un stress du réticulum endoplasmique. Elle se caractérise par une augmentation de l’expression de gènes cibles d’ATF4, dont les facteurs de transcription proapoptotiques Atf3 et sa cible potentielle Gadd153. Au cours de mon mémoire, j’ai étudié le rôle d’Atf3 dans l’apoptose des cellules d’îlots de souris cultivées en présence de concentrations extrêmes (faible et élevée) de glucose.
Comme dans les îlots de rat, la culture d’îlots de souris C57BL/6J (Ctrl) en présence de G2 au lieu de G10 augmente rapidement (18h) l’expression des ARNm d’Atf3 et de Gadd153 (PCR en temps réel) et plus tardivement (3-7 jours) l’apoptose des cellules de l’îlot (mesures de l’activation des caspases et de la fragmentation de l’ADN). Par contre, la culture de ces îlots en présence de G30 vs G10 n’augmente que très légèrement l’expression des gènes de l’ISR ainsi que l’apoptose. Dans des îlots de souris dont le gène Atf3 a été inactivé (souris Atf3-/-), l’effet du G30 vs G10 sur l’expression des gènes de l’ISR et sur l’apoptose n’est pas différent de celui observé dans les îlots de souris Ctrl. Par contre, le taux d’apoptose induit par une semaine de culture en G2 est ~50% plus faible dans les îlots de souris Atf3-/- pour la moitié des expériences (3/7) et comparable pour les autres expériences (réduction moyenne de ~25% pour toutes les expériences). Parallèlement, le taux d’expression de l’ARNm de Gadd153 est significativement plus faible dans les îlots de souris Atf3-/- après 3 et 7 jours de culture en présence de G2 malgré un taux semblable observé après 18h de culture. D’autre part, l’expression de l’ARNm du gène de réponse au stress oxydant métallothionéine 1a (Mt1a), dont la surexpression a des effets antiapoptotiques dans les cellules β, est significativement augmentée dans les îlots de souris Atf3-/- comparés aux îlots de souris Ctrl après 18h de culture en présence de G2, mais aucune différence n’est observée après 3 et 7 jours de culture.
En conclusion, l’augmentation d’expression d'Atf3 contribue de façon peu reproductible à l’apoptose des cellules des îlots de souris cultivés en présence d’une concentration faible de glucose par un mécanisme qui pourrait impliquer une augmentation tardive de l’expression du gène proapoptotique Gadd153 ou une diminution précoce de l’expression du gène antiapoptotique Mt1a

Activating Transcription Factor 3 --- Insulin-Secreting Cells --- Apoptosis

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Les ROS ont depuis toujours été considérés nocifs pour les cellules P pancréatiques car ils altèrent la structure et la fonction des composants moléculaires de la cellule. Cependant, une théorie récente accorde un rôle bénéfique à l'H202. En effet, en agissant en tant que messager secondaire, il aurait la capacité d'activer la stimulation de la sécrétion d'insuline par le glucose. Cette théorie est toutefois controversée. Il a ainsi été démontré que si l'on surexprime dans les cellules p la catalase qui décompose l'H202 en H20 et 02, on ne modifie pas la stimulation de la sécrétion d'insuline par le glucose.L'objectif de mon mémoire est d'étudier de manière approfondie les éventuels changements de la concentration d'H202 dans la cellule p, et plus particulièrement dans le cytosol et la matrice mitochondriale de ces cellules, suite à la stimulation par différents nutriments . Pour cela, nous avons décidé d'utiliser la sonde protéique ratiométrique roGFP2-0rpl, un outil permettant de détecter spécifiquement l'H202, encodée par un adénovirus. Nous avons fabriqué la sonde mitochondriale à partir de la sonde cytosolique à laquelle une séquence d'adressage mitochondriale a été ajoutée.J'ai d'abord montré que la sonde roGFP2-0rpl était effectivement sensible à l'H202 : elle détecte des concentrations d'H202 relativement faibles, 5 µM dans le cytosol et 20 µM dans la matrice mitochondriale. Ensuite, j'ai observé que la stimulation par le glucose ne provoquait pas de modification de la concentration d'H202 dans le cytosol de la cellule p. Néanmoins, enprésence de 15 µM d'H202 d'origine exogène, j'ai observé une augmentation de l'oxydation de la sonde cytosolique lorsque la concentration de glucose est réduite de 10 à 0.5 mM, suggérant que le glucose protège les cellules p pancréatiques en modulant leur capacité dedégradation de l'H202 exogène. Stimuler des cellules p pancréatiques avec des substrats mitochondriaux insulinosécrétagogues semble également les protéger face à l'H202. Dans la mitochondrie, la sonde roGFP2-0rpl est davantage oxydée que dans le cytosol quelle que soit la concentration de glucose à laquelle les cellules sont exposées. Cependant, j'ai observé une augmentation de l'oxydation de la sonde mitochondriale lors d'une diminution de la concentration de glucose de 10 à 2 mM en absence d'H202 exogène. Ceci suggère que la production mitochondriale d'H202 est plus faible en présence d'une concentration stimulantede glucose ou bien que sa dégradation par les défenses antioxydantes est accélérée. Car en effet, après la surexpression de la mitocatalase dans les cellules p pancréatiques, l'effet du G2 sur la sonde mt-roGFP2-0rpl n'est pas modifié, suggérant qu'il n'y a pas d'augmentation de la production mitochondriale d'H202 lors de l'exposition au G2. ROS have always been considered harmful to pancreatic P-cells because they alter the structure and the function of molecular components of the cell. However, a recent theory grants a beneficial role to H202. In fact, by acting as a secondary messenger, it would have the ability to activate glucose-stimulated insulin secretion. This theory is nevertheless controversed. Indeed, it has been shown that P-cells overexpression of catalase, which decomposes H202 in H20 and 02, does not change the glucose-stimulated insulin secretion.The aim of my master thesis is to investigate thoroughly any change in the concentration of H202 in the P-cells, and more particularly in the cytosol and the mitochondrial matrix of these cells, following the stimulation by different nutrients. For this, we decided to use the ratiometric and proteic probe roGFP2-0rpl, a specific tool for the detection of H202, encoded by an adenovirus. We constructed the mitochondrial probe by adding a mitochondrial targeting sequence to that coding the cytosolic probe.I first showed that roGFP2-0rpl was highly sensitive to H202 : it detected relatively low concentrations of H202, 5 µM in the cytosol and 20 µM in the mitochondrial matrix. Then I observed that the glucose stimulation caused no change in the concentration of H202 in the cytosol of pancreatic P-cells. However, in the presence of 15 µM of exogenous H202, I observed an increase in the oxidation of the cytosolic probe when the glucose concentration was reduced from 10 to 0.5 mM, suggesting that the glucose protects P-cells by modulating their ability to degrade exogenous H202. It seems that the stimulation of pancreatic P-cells with insulin secretagogue mitochondrial substrates also protects them against H202. In the mitochondria, the probe roGFP2-0rp 1 is more oxidized than in the cytosol for any glucose concentration to which the cells are exposed. However, I have observed an increase in the mitochondrial oxidation of the probe during a decrease of the glucose concentration from 10 mM to 2 mM in the absence of exogenous H202. This suggests that the mitochondrial production of H202 was lower in the presence of a stimulating glucose concentration or that its degradation by the antioxidant defenses was accelerated. Indeed, after the overexpression of mitocatalase in pancreatic P-cells, the effect of G2 on the probe mt-roGFP2-0rp 1 was not changed, suggesting that H202 production does not increase upon exposure to G2 .

Insulin-Secreting Cells --- Cytosol --- mitochondrial processing peptidase

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The type II diabetes is a disease with serious consequences for human health and on health and health economics. The WHO has announced in January 2015 that in 2030 diabetes would be the seventh leading cause of death in the world. Despite all the treatments available today, monitoring of blood sugar in diabetics is a daily challenge. The Glucokinase Activators (GKA) which are administered orally, showed inconclusive results in recent years in clinical studies. This work synthesizes the discovery of different families of GKA, their modes of action and the corresponding clinical studies. Le diabète de type II est une malad ie ayant de graves conséquences sur la santé de l 'homme et sur l'économie de la santé. L'OMS avait déclaré en janvier 2015 qu'en 2030 le diabète serait la 7ème cause de décès dans le monde. Malgré tous les traitements disponibles à ce jour, le contrôle de la glycémie chez les diabétiques est un challenge quotidien pour les chercheurs. Les Activateurs de la GlucoKinase (GKA) qui sont administrés par voie orale, ont montré des résultats concluants ces dernières années durant les études cliniques. Ce travail synthétise la découverte des différentes familles des GKA, leurs modes d'action et les études cliniques correspondantes.

Glucokinase --- Diabetes Mellitus, Type 2

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Type 2 diabetes (T2DM) is associated with a high cardiovascular risk. Therefore, there is a real need for a preventive treatment to limit the occurrence of cardiovascular complications of T2DM. Thus, drugs that allow a glycemic control and provide a cardio-protective protection are emerging. Indeed, clinical trials have resulted in new drugs associated with a cardiovascular benefit among patients with T2DM who were at high cardiovascular risk: these are inhibitors of co-transporter sodium-glucose type2 (SGLT2) at the renal level with empagliflozin and canagliflozin as well as glucagon-like peptide 1 (GLP-1) analogues with liraglutide and semaglutide. Le diabète de type 2 (DT2) est associé à un risque cardio-vasculaire élevé. Par conséquent, il existe un réel besoin de traitements préventifs pour limiter la survenue des complications-vasculaires du TD2. C’est ainsi que des médicaments qui permettent un contrôle glycémique et qui confèrent une protection cardio-protectrice voient le jour. En effet, des essais cliniques ont abouti à de nouveaux médicaments associés à un bénéfice cardio-vasculaire parmi les patients atteints par le DT2 et qui présentaient un risque cardio-vasculaire élevé : il s’agit des inhibiteurs du cotransporteur sodium-glucose de type 2 (SGLT2) au niveau rénal avec l’empagliflozine et la canagliflozine aonsi que les analogues du glucagon-like-peptide-1 (GLP-1) avec le liraglutide et le semaglutide.

Diabetes Mellitus, Type 2 --- Diabetic Angiopathies --- Cardiovascular Diseases