Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Au cours du développement de la moelle épinière, la mise en place des circuits neuronaux qui contrôlent la locomotion dépend de l'action de plusieurs morphogènes. Un gradient de Sanie Hedgehog (Shh) et de Bone morphagenic prateins (BMPs) contrôlent l'expression de gènes spécifiques menant à la subdivision de la moelle en différents domaines progéniteurs situés le long de l'axe dorso-ventral. Ces domaines vont donner naissance, en fonction des facteurs de transcription qu'ils expriment, à différentes populations neuronales. Dans la région ventrale de la moelle, il existe 4 domaines progéniteurs (pO à p3), générant différentes populations d'interneurones (INs), de VO à V3, et un domaine progéniteur (pMN) qui produit des motoneurones (MNs). Le domaine progéniteur p2 produit 5 populations d'INs, chacune caractérisée par des marqueurs et des fonctions spécifiques, les V2a et V2b, produits plus tôt que les V2c, V2d et les V2-Pax6. Des études menées dans le laboratoire d'accueil ont montré que le domaine p2 produit de manière précoce au cours du développement une population intermédiaire d'INs V2 encore non décrite jusqu'à présent. Ces cellules sont qualifiées comme étant « intermédiaires » car elles sont sorties du cycle cellulaire mais n'ont pas encore entamées leur différenciation. Ce compartiment intermédiaire est caractérisé par l'expression transitoire du répresseur transcriptionnel, Visual System Homeobox 1 (Vsx1) au cours du développement. Cependant, le rôle de Vsx1 dans la moelle épinière n'est pas encore connu. Des études en « perte de fonction » chez la souris, suggèrent que ce facteur n'est pas nécessaire à la différenciation des INs V2. Pour compléter ces études, mon projet de mémoire a pour objectif d'étudier les effets de l'expression ectopique de Vsx1 dans la moelle épinière en développement chez des souris transgéniques Tg[Nestin:Cre]/Rosa26vrrii+. Pour ce faire, nous avons tout d'abord validé le modèle en « gain de fonction » par qPCR, hybridations in situ et immunofluorescences. Nos observations montrent que le modèle est valide. En effet, l'ARNm et la protéine Vsxl sont détectés de manière ectopique chez le mutant mais à un niveau différent dans les progéniteurs et dans les cellules différenciées, suggérant un mécanisme de répression au cours de la différenciation neuronale. Ensuite, nous avons analysé par immunofluorescences les conséquences de l'expression ectopique de Vsxl dans les progéniteurs neuraux à e!0,5 et dans les neurones différenciés (INs V2, MNs, INs V3) à el2,5. Les résultats montrent que l’expression ectopique de Vsx1induit une augmentation significative du nombre d'INs V2a et de V2b avec en parallèle une diminution du nombre de MNs à el 2,5. Ces résultats suggèrent que Vsx1 pourrait avoir deux rôles, d'une part il pourrait stimuler la différenciation des INs V2. D'autre part, il pourrait inhiber la différenciation des MNs. Au vu des études récentes à propos du mécanisme de consolidation de l'identité INs versus MNs (Clovis et al.,2016), nos observations suggèrent que Vsx1agit de manière similaire à son paralogue Chxl O en se liant à l'élément de réponse à l'hexamère du gène codant pour Hb9, spécifique des MNs ce qui empêcherait les cellules de se différencier en MNs. L'hypothèse de travail proposée est que Vsx1 sécurise l'identité V2 dans les précurseurs neuraux en stimulant la différenciation en INs V2 et en inhibant le programme de différenciation en MNs dans ces cellules. During the development of the spinal cord, the establishment of the neuronal circuits that control locomotion depends on the action of many morphogens and transcription factors. A gradient of Sonic Hedgehog (Shh) and Bone morphogenic proteins (BMPs) signaling control the expression of patterning genes leading to the subdivision of the spinal cord into different progenitor domains orderly distributed along the dorso-ventral axis. These domains will give rise, depending on the combination of transcription factors they express, to different populations of neurons. In the ventral spinal cord, four progenitor domains (pO to p3) generate different populations of interneurons (INs) VO to V3, and one single progenitor domain (pMN) generates all the motor neurons (MNs). The progenitor domain p2 has been reported to generate five V2 interneuron subsets, each characterized by specific molecular markers and functional properties. The major V2 subsets correspond to the V2a and V2b INs which are generated earlier than the V2c, V2d and V2-Pax6. Studies carried out during in the host laboratory provided evidence that the p2 domain produces an early intermediate V2 compartment that was not described yet. These cells were qualified as "intermediate" because they have exited the cell cycle but have not yet initiated neuronal differentiation. This precursor compartment is characterized by the transient presence of the transcriptional repressor Visual System Homeobox 1 (Vsx1) during development. However, the role of Vsx1 in the spinal cord is not yet known. Loss-of-function analyses in the mouse show that Vsx1 is not necessary for the production of V2a and V2b INs. To complete these studies, my Master thesis aims at studying the consequences of overexpressing Vsx1in the developing spinal cord in a transgenic mouse line Tg[Nestin:Cre]/Rosa26v"JH.To do this, we firstly validated the "gain of function" model by qPCR, in situ hybridization and immunofluorescence labeling. Our observations indicate that the model is valid. Indeed mRNA and protein Vsx1are detected ectopically in the mutant spinal cord. However, the expression levels were variable in different populations, which suggest the existence of a possible repression mechanism in specific neuronal types. Then we analyzed by immunofluorescences the consequences of this gain of function in early-born neurons at el 0.5 and in the differentiating neurons (V2 INs, MNs, V3 INs) at e12.5. The results showed that overexpression of Vsx1 induces a significant increase in the number V2a and V2b INs at el2.5 paralleled with a decrease in the number of MNs. These results suggest that Vsx1 could have two roles. On the one hand, it could stimulate the differentiation of V2 INs. On the other hand he could inhibit the differentiation of the MNs. In the light of recent studies on the mechanism of consolidation of IN and MN identity (Clovis et al., 2016), our observations suggest that Vsx1 acts similarly to its paralog Chx1O by binding to a hexamer response element in the MN-specific Hb9, gene thereby preventing cells to differentiate in MNs. The working hypothesis we propose is that Vsx1 secure V2 identity in the early-born neurons that initiate V2 INs differentiation and inhibit the MNs differentiation program in these cells.

Spinal Cord --- Mice --- Ectopic Gene Expression

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

The Onecut (OC) transcription factors control motor neuron diversification in the ventral embryonic spinal cord. They contribute to maintain lsl1 expression in newborn motorneurons, which enables the maintenance of proper ratio between somatic and visceral motor neurons in at thoracic levels and the maintenance of a LMC subpopulation in the limb regions. In Hnf6/0c2-/- mutant embryos, visceral motor neuron production is increased at the expense of somatic motor neurons at the thoracic level. At limb levels, cell identity of the LMCm neurons is converted into that of the LMCI neurons. In my host laboratory, it was previously shown that, in the absence of OC factors, several Vl IN populations are affected while they normally do not contain OC factors. These results suggest a non-cell autonomous regulation of interneuron development, potentially by motor neurons. In embryos wherein motor neurons were eliminated very early during embryonic development, the number of V2 IN increased and migration of these cells was impaired. These results suggest that OC factors may regulate in motor neurons a genetic program that would modulate the development of surrounding interneuron populations. To assess this hypothesis, studied conditional mutants in wherein OC factors were specifically inactivated in motor neurons. In this study, we show that the three OC factors were absent from the spinal motor neurons of these embryos, which validates the model. Fluorescence immunolabelings and quantifications allowed analyzing different neuronal populations in the ventral spinal cord. While motor neuron production was not affected in the mutant embryos, the V2c interneurons were completely absent. However, this loss was due to the absence of Onecut-2 in the spinal cord of our conditional mutants. We also show that V2a and V2b interneurons distribution was impaired. The differences we could observe are partly similar to alterations previously detected in OC constitutive mutants. If OC factors control in MN a genetic program that regulates the development of neighboring IN, overexpressing one of them in MN could disturb that genetic program and this IN development. We also worked with a gain of function model wherein Onecut-1 (HNF-6) was specifically overexpressed in the motor neuron population. In these embryos, the proportion of motor neurons containing HNF-6 was indeed increased, at least in some portions of the spinal cord. The same fluorescence immunolabelings and quantification methods showed that, the V2a and V2b interneuron distribution was altered, similarly to what we observed in our first experimental model. At variance, V2c production was not impaired. The Hn/6 expression stayed unchanged in the neighboring interneurons populations. Together, these results suggest that the OC factors control in motor neurons a genetic program that modulates the development of certain ventral interneuron populations in a non-cell autonomous manner. Les facteurs de transcription Onecut contrôlent la diversification des motoneurones dans la moelle embryonnaire ventrale. Ils permettent le maintien de l'expression d'Is/1 dans les motoneurones précoces, contribuant ainsi à maintenir l'équilibre de production des motoneurones somatiques et des motoneurones viscéraux en région thoracique, ainsi que le maintien de l'identité d'une sous­ population de la colonne motrice latérale (LMC) au niveau des membres. Chez les embryons doubles mutants Hnf6/0c2-/-, la production de motoneurones viscéraux est augmentée au détriment des motoneurones somatiques au niveau thoracique. Aux niveaux des membres, on observe une conversion de l'identité des cellules de la LMCm en LMCI. Dans mon laboratoire d'accueil, il a été montré que, chez ces mêmes embryons, différentes populations d'interneurones V1 sont affectées alors qu'on n'y détecte normalement pas de facteurs OC. Ceci suggère l'existence d'un contrôle extrinsèque du développement des interneurones ventraux, peut-être par les motoneurones. L'étude d'embryons chez lesquels les motoneurones sont éliminés très tôt au cours du développement a montré une augmentation du nombre de cellules et une migration altérée des interneurones V2. Ces données expérimentales suggèrent que les facteurs Onecut pourraient exercer un contrôle extrinsèque du développement de certaines populations d'interneurones ventrales, via la régulation d'un programme génétique dans les motoneurones. Pour tester cette hypothèse, nous avons étudié des embryons mutants conditionnels pour les facteurs Onecut chez lesquels ces derniers sont inactivés dans les motoneurones. Au cours de cette étude, nous montrons que les trois facteurs Onecut sont effectivement absents des motoneurones de ces embryons, ce qui valide le modèle expérimental utilisé. Des méthodes d'immunomarquage en fluorescence et des quantifications nous ont permis d'analyser différentes populations de la moelle ventrale. Bien que la production de la plupart des interneurones ventraux soit inchangée chez les embryons mutants, les interneurones V2c sont presque totalement absents. Nous mettons en évidence le fait que cette perte est due à l'absence d’Onecut-2 de la moelle de nos mutants conditionnels. Nous montrons également que la distribution des populations d'IN V2a et V2b est affectée. Cependant, l'expression d'Hnf6 semble inchangée dans les différentes populations d'interneurones ventraux. Les différences observées sont en partie similaires aux résultats obtenus dans d'autres études chez des embryons mutants constitutifs pour les facteurs OC. Afin d'éventuellement confirmer les résultats obtenus dans notre modèle de perte de fonction, nous avons également travaillé sur un modèle de gain de fonction, consistant en des embryons chez lesquels le facteur Onecut-1 (ou HNF-6) est surexprimé uniquement dans les motoneurones. Chez ces embryons, la proportion de motoneurones contenant HNF-6 est effectivement plus élevé dans une partie au moins de la moelle épinière. Les mêmes méthodes d'immunofluorescence et de quantifications ont montré que, contrairement à ce qui peut être observé notre premier modèle, la production des interneurones V2c ne semble pas compromise. Cependant, la distribution des interneurones V2a et V2b semble perturbée, comme observé en perte de fonction. L'expression d'Hnf6 est inchangée dans les populations d'IN voisines. Ensemble, ces résultats suggèrent que les facteurs OC contrôlent dans les MN un programme génétique qui régule de façon extrinsèque la production ainsi que la distribution de certaines populations d'interneurones ventraux.

Hepatocyte Nuclear Factor 6 --- Onecut Transcription Factors --- Spinal Cord Ventral Horn

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Le développement du système nerveux implique l'action de nombreux facteurs de transcription et morphogènes dont Sonic Hedgehog. Ce dernier, indispensable à la mise en place de la région ventrale de la moelle épinière, induit, en fonction de son gradient de concentrat ion, cinq domaines progéniteurs donnant naissance à quatre classes d'interneurones (IN) ventraux (VO­ V3) et à une classe de motoneurones. Dans le cadre de ce projet, l'intérêt s'est principalement porté sur les IN V2 jou ant un rôle dans l'alte rnance droite-gauche (V2a) et dans l'alternance de contraction des muscles fléchisseurs-extenseurs (V2b) lors d'une démarche rapide, ainsi que sur leurs sous-populations respectives. Ces populations et sous-populations d'IN sont caractér isées par une combinaison de facteurs de transcription, dont les facteurs Onecut. Ces derniers (OC-1 ou HNF-6, OC-2 et OC-3), qui sont exprimés durant le développement de la moelle épinière, sont, entre autres, nécessaires à la différenciation des sous-populati ons d'IN chez la souris.Au cours de ce projet, l'objectif principal est de déterminer si l'embryon de poulet est un modèle expérimenta l pouvant être utilisé pour des études de perte-de-fonct ion et de gain-de­ fonction visant à caractér iser les mécanismes contrôlant la diversification des IN ventraux. Pour ce faire, nous avons d'abord identifié les populations et sous-populations d'IN V2 chez l'embryon de poulet et étudié la distribution du facteur Onecut de poulet (cOC-1) au sein de celles-ci. Ensuite, pour la perte-de-fonction, nous avons étudié, à l'aide de quatre siRNA se liant à des endroits différents sur la séquence codante du gène cOcl, l'inhibition de cOcl au sein de la moelle. Enfin, pour l'étude en gain-de-fonction, nous avons analysé l'effet d'une surexpression d' Ocl, restreinte aux IN V2, sur la différenc iation de ces populations .Par immunomarquages , nous avons observé une conservation des principales sous-populati ons d'IN V2 entre la souris et le poulet ainsi qu'une expression de cOcl dans celles-ci. En ce qui concerne l'inhibition de cOcl, nous n'avons pas pu mettre en évidence une réelle diminut ion significative de ce facteur chez les embryons électroporés. Quant à la surexpression d 'Ocl, nous avons démontré la spécificité et l'efficacité du vecteur, préalablement construit, à exprimer Ocl dans les IN V2. Le nombre de ces IN ne varie pas de manière significative entre les deux côtés de la moelle. Nous avons finalement montré qu'une surexpression de ce facteur dans les IN V2 stimule l'expression d' ls/1, un marqueur précoce des MN. Nous pouvons, dès lors, affirmer que le poulet est un bon modèle pour des études en gain-de-fonction. The development of the nervous system involves the action of many transcription factors and morphogens, including Sonic Hedgehog. This factor is necessary for the establishment of the ventral spinal cord. lt induces, according to its concentration gradient, the production of five progenitors domains. These give rise to four classes of ventral interneurons {IN), named VO to V3 and one class of motor neurons, which are all subdivided into populations and subpopulations. The main goal of this project has been focused on the V2 IN, which play a role in the left-right alternation during rapid locomotion (V2a) and in the alternation of contractions of the flexor-extensor muscles {V2b), and on their respective subpopulations. These populations and subpopulations are characterized by a specific combinations of transcription factors, including Onecut factors . The latter's (OC-1 or HNF-6, OC-2 and OC-3), which are expressed during the development of the spinal cord, are necessary for the differentiation of IN subpopulations in mouse embryos.During this project, the main objective was to determine if the chick embryo is an experimental model that can be used for loss-of-function or gain-of-function studies to characterize the mechanisms controlling the diversification of ventral INs. First, we identified populations and subpopulations of V2 IN in the chick embryo and we studied the distribution of the chicken Onecut factor (cOC-1) within them. Then, for the loss-of-function analysis, we characterized the inhibition of c0c1 in the chick spinal cord, using four siRNA that bind at different locations on the coding sequence of the cOC-1 gene. Finally, for the gain-of-function study, we analyzed the effect of overexpressing of Oc1 specifically in the V2 IN on the differentiation of these populations.Using immunostaining, we observed a major conservation of the subpopulations of V2 IN between mouse and chicken as well as of the expression of c0c1 therein. Regarding the inhibition of c0c1 expression, we have not been able to demonstrate a significant downregulation of this factor in electroporated embryos. As for the overexpression of Oc1, we demonstrated the specificity of the vector that we constructed to target V2 IN and overexpress Oc1 therein. However, the number of V2 IN did not vary significantly between the two sides of the cord. Finally we showed that overexpress ion of this factor in the V2 IN stimulated the expression of /s/1, an early marker of MN known as a direct target of OC factors. Hence, we can conclude that the chicken embryo is a good model for gain-of-function studies .

Onecut Transcription Factors --- Interneurons --- Embryonic Development