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Le foie est un organe qui assure plusieurs fonctions importantes de synthèse, d’épuration et de stockage. Au regard de l’importance de ces fonctions les affections pouvant altérer son fonctionnement normal sont diverses et ont le plus souvent de graves conséquences. La greffe de foie a longtemps été la seule alternative face à toutes les maladies hépatiques graves. Récemment, a émergé la technique de transplantation des hépatocytes dont la réussite nécessite une suspension cellulaire de bonne qualité ainsi qu’un nombre suffisant d’hépatocytes.
Le but de ce mémoire s’inscrit dans le cadre des études menées au laboratoire d’hépatologie pédiatrique & thérapie cellulaire visant à améliorer la qualité des cellules destinées à la transplantation par l’isolement d’une source cellulaire ayant la capacité de proliférer et de se trans-différencier en hépatocytes. Ce travail a été réalisé sur des suspensions cellulaires obtenues après un isolement de foie humain à la collagénase et s’est focalisé sur la caractérisation des types cellulaires obtenus après culture primaire.
La première partie de mon mémoire consistait à évaluer la qualité de la suspension cellulaire obtenue après isolement de 3 foies humains. La culture primaire d’hépatocytes est ensuite caractérisée aux niveaux immunocytochimique, génétique (RT-PCR) et fonctionnel dés les premières 24 heures de la culture. Les résultats obtenus confirment la prédominance des hépatocytes (immunopositifs pour l’albumine et la cytokératine (CK) – 18), dans la culture, qui restent métaboliquement fonctionnels (mesures d’urée dans le surnageant de culture) jusqu’à deux semaines de culture. Les résultats de RT-PCR ont permis de démontrer la présence minoritaire d’autres types cellulaires exprimant la CK-19 et l’alpha-fétoprotéine (AFP).
La deuxième partie de ce travail qui a consisté en l’étude de nouveaux types cellulaires émergents au décours de la culture primaire, morphologiquement différents, et constitués de petits hépatocytes, de cellules épithéliales – like et de cellules mésenchymateuses – like. Etant donné l’hétérogénéité de la culture, seules des études d’immunocytochimie ont été réalisées. Les petits hépatocytes et les cellules épithéliales – like expriment l’AFP reflétant leur état immature ainsi que des marqueurs hépatocytaires (albumine) et biliaires (CK-19). Ces résultats, qui doivent être complétés par d’autres expériences, suggèrent que ces cellule en détenant des caractéristiques intermédiaires entre les hépatocytes et les cellules biliaires puissent constituer une réserve de cellules progénitrices intrahépathiques.
Le troisième type cellulaire est représenté par les cellules mésenchymateuses – like qui possèdent des caractéristiques de cellules stellaires (vimentine & Alpha-actine de muscle lisse) et hépatocytaires (albumine). Des travaux complémentaires sont nécessaires afin de mieux caractériser ces cellules après purification avant de pouvoir les propose comme sources potentielles de cellules progénitrices

Liver --- Hepatocytes --- Cells --- Epithelial Cells

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Liver --- Biopsy --- Liver Diseases --- Hepatocytes --- Biopsy. --- pathology. --- methods.

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As for now, the standard treatment for liver metabolic disease remains liver transplantation. However this treatment is limited by the shortage of donors, prompting researchers to find alternative therapy methods such as cell therapy. In this context, the PEDI laboratory has established a method to isolate and cryopreserve hepatocytes from adult human livers in order to inject them via the portal vein (a process called infusion) for patients awaiting transplantation or not wishing to undergo such a heavy treatment. Although this method has improved the clinical parameters associated with these diseases, it also highlighted some limitations such as the loss of long-term effectiveness, the difficulty of hepatocytes to resist cryopreservation and scarcity body, encouraging researchers to find alternative sources for cell therapy. Recently, the laboratory PEDI managed to highlight and isolate from the parenchymal fraction obtained after digestion of human liver, a population with characteristics of mesenchymal stem cells. These cells have the advantage of being able to multiply in vitro, to weather the cryopreservation and can differentiate into hepatocyte-like cells in vitro and in vivo. Based on these data, the company "Promethera Biosciences" (PROM) developed a cell therapy product made from allogeneic liver progenitor cells named "HepaStem This product can be administered via a catheter placed in the patient's portal vein. This allows the cells to migrate and settle in the liver of the recipient where they will differentiate into mature hepatocytes. The purpose of this curative therapy is to introduce the deficient enzyme functions in patients with congenital metabolic diseases. Objective of the study : In order to pass to the next clinical trial phases (III and N), it is important to assess the individual immune response of patients who received the product within the clinical phase I / II study. It is well known that during a liver transplant immunosuppressive therapy is essential without which the liver might be rejected by the host. Given that the product "HepaStem" contains allogeneic liver cells, it is currently administered with an immunosuppressive regime to prevent the immune system to recognize the cells as foreign. However, PEDI Laboratory research has shown that the hepatic progenitor cells are poorly immunogenic m vitro, suggesting that immunosuppression is perhaps not essential. In addition, one must take into account the balance among the benefits and side effects of immunosuppressive drugs including a higher vulnerability to mild infections. Therefore, to better calibrate immunosuppressant’s that must be taken with the product “HepaStem”, it would be advantageous to find predictive markers of rejection or tolerance. The project’s aim is to track patients in liver cell-based therapy of liver progenitor cells and evaluate various immune markers of tolerance and rejection in order to reduce in the future, for each individual, the immunosuppressant administered to the minimum necessary. The specific objective of this clinical research paper work is the development of two tests and their application to patient samples. Methodology: twelve patients with liver cell therapy with progenitor cells (“HepaStem”) were monitored as part of this work: 6 suffering from a deficit in the urea cycle. Blood samples were taken before injection of the product “HepaStem” then update (J) J14, J30, to months (M), M3, M6, M8 and M12. The serum of patients was harvested and frozen for subsequent use in an essay to test HLA-G (tolerance marker). Similarly, although the technique of Elispot already exists, it is generally used with non-adherent cells. It has therefore been adapted to the mixture of adherent cells and PBMCs. The optimal conditions for the incubation of the PBMCs of patients with the cells “HepaStem” had to be investigated before testing on patients’ samples.Results : the developed techniques for detecting HLA by Luminex and Elispot were performed with success and have enabled the establishment of protocols that can be used to test patients samples. However, HLA-G could be detected in the serum of patients, either before or after injection of the product HepaStem. Under the Elisport assay, incubation of the PBMCs of patients obtained at different times with an anti-CD3 antibody (non-specific stimulation) showed high variability, making it difficult to interpret results obtained with HepaSTEM cells, although these seem to induce a basic response (before injection) more important for the differentiated state as for the undifferentiated. Jusqu'à présent, le traitement de référence pour les maladies métaboliques du foie reste la transplantation hépatique. Cependant ce traitement est limité par la pénurie de donneurs, ce qui a incité les chercheurs à trouver des méthodes de thérapie alternatives telles que la thérapie cellulaire. Dans ce contexte, le laboratoire PEDI a établi une méthode permettant d'isoler et de cryopréserver des hépatocytes à partir de foies humains adultes dans le but de les injecter via la veine porte (par un procédé appelé infusion) aux patients en attente de greffe ou ne souhaitant pas avoir recours à une procédure aussi lourde. Bien que cette méthode ait permis d'améliorer les paramètres cliniques associés à ces maladies, elle a aussi mis en évidence certaines limitations telles que la perte d'efficacité à long terme, la difficulté des hépatocytes à résister à la cryo-préservation et la pénurie d'organe, encourageant les chercheurs à trouver des sources alternatives pour la thérapie cellulaire. Récemment, le laboratoire PEDI a réussi à mettre en évidence et isoler, à partir de la fraction parenchymateuse obtenue après digestion du foie humain, une population ayant les caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses. Ces cellules présentent l'avantage de pouvoir se multiplier in vitro de bien résister à la cryo préservation et de pouvoir se différencier en cellules hépatocyte-like tant in vitro qu'in vivo. Sur base de ces données, l’entreprise« Promethera Biosciences » (PROM) a développé un produit de thérapie cellulaire à base de cellules pro-génitrices hépatiques allogéniques nommé «HepaStem ». Ce produit peut être administré via un cathéter placé dans la veine porte du patient. Ceci permet aux cellules de migrer et de s'implanter dans le foie du receveur où elles vont se différencier en hépatocytes matures. Le but de cette thérapie curative est de pouvoir incorporer les fonctions enzymatiques déficientes chez des patients atteints de maladies métaboliques congénitales. Des essais cliniques de phase I et II ont déjà commencé en 2012.Objectif de l'étude : Afin de pouvoir passer aux prochaines phases d'essai clinique cm et IV), il est important de faire une évaluation de la réponse immunitaire individuelle des patients qui ont reçu le produit dans le cadre de l'étude clinique de phase I/II. Il est bien connu que lors d'une greffe hépatique un traitement immunosuppresseur est indispensable sans lequel le foie risquerait d'être rejeté par l'hôte. Etant donné que le produit « HepaStem » contient des cellules hépatiques allogéniques, il est actuellement administré avec un régime immunosuppresseur pour éviter que le système immunitaire ne reconnaisse les cellules comme étant étrangères. Cependant, les recherches du laboratoire PEDI ont démontré que les cellules pro-génitrices hépatiques sont peu immunogènes in vitro, suggérant que l'immunosuppression n'est peut-être pas indispensable. Par ailleurs, Il faut tenir compte de la balance entres les bénéfices et les effets secondaires des immunosuppresseurs notamment une plus haute vulnérabilité aux infections bénignes.C'est pourquoi, en vue de mieux doser les immunosuppresseurs qui doivent être pris avec le produit « HepaStem », il serait avantageux de trouver des marqueurs prédictifs de rejet ou de tolérance. L'objectif du projet auquel se rattache ce mémoire de recherche clinique est à la fois d'effectuer un suivi des patients en thérapie cellulaire hépatique à base de cellules pro-génitrices hépatiques et d'évaluer différents marqueurs immunitaires de tolérance et de rejet dans le but de pouvoir dans le futur réduire pour chaque individu les immunosuppresseurs administrés au minimum nécessaire.L'objectif spécifique de ce travail de mémoire de recherche clinique est la mise au point de deux tests et leur application aux échantillons de patients. Méthodologie : douze patients en thérapie cellulaire hépatique à base de cellules pro-génitrices (« HepaStem ») ont été suivis dans le cadre de ce travail : 6 souffrant de la maladie de Crigler-Najjar, et 6 souffrant d'un déficit du cycle de l'urée. Des prélèvements sanguins ont été effectués avant l'injection du produit « HepaStem », puis à jour (J) J14, BO, aux mois (M) M3, M6, M8 et M12. Le sérum des patients a été récolté et congelé pour utilisation ultérieure dans un test de dosage du HLA-G (marqueur de tolérance). De même les cellules mononucléées du sang périphérique (Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) ont été isolées et cryo-préservées pour utilisation ultérieure dans un test de type ELISpot afin de détecter des cellules produisant de l'interféron gamma (IFN-g). Le test pour la détection du HLA-G soluble dans le sérum n'étant pas disponible commercialement, la technique a dû être mise au point avant son utilisation sur les échantillons de patients. De même, bien que la technique de l'ELISpot existe déjà, elle est généralement utilisée avec des cellules non-adhérentes. Elle a donc été adaptée au mélange de cellules adhérentes et PBMCs. Les conditions optimales pour la co­incubation des PBMCs des patients avec les cellules "hepastem" ont dû être investiguées avant test sur les échantillons des patients. Résultats : Les mises au point des techniques de détection du HLA-G par Luminex et d'ELISpot ont été effectuées avec succès et ont permis la mise en place de protocoles pouvant être utilisés pour tester les échantillons de patients. Cependant, la molécule HLA-G n'a pu être mise en évidence dans le sérum des patients, ni avant ni après injection du produit Hepastem. Dans le cadre du Test Elispot, l’incubation des PBMCs des patients obtenus à différents temps avec un anticorps anti-CD3 (stimulation non spécifique) a montré une très grande variabilité rendant difficile l’interprétation des résultats obtenus avec les cellules « HepaStem ». Dans l’ensemble, on remarque, après normalisation, qu’il n’y a que peu de réponses aux cellules « HepaStem »., même si celles-ci semblent induire une réponse de base (avant injection) plus importante à l’état différencié que non-différencié.

Biomarkers --- Cell- and Tissue-Based Therapy --- Hepatocytes --- Immunosuppressive Agents

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Liver --- Liver Cirrhosis, Experimental --- Hepatocytes --- Liver Cirrhosis --- Histocytological Preparation Techniques --- drug effects --- drug therapy --- pathology --- pathology

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Gene expression --- Genetic regulation --- Liver cells --- Liver --- Gene Expression Regulation --- Liver Neoplasms --- Expression Regulation, Gene --- Regulation, Gene Action --- Regulation, Gene Expression --- Gene Action Regulation --- Regulation of Gene Expression --- RNAi Therapeutics --- Gene Regulatory Networks --- Abdomen --- Biliary tract --- Hepatic cells --- Hepatocytes --- Cells --- Congresses --- Metabolism&delete& --- Regulation&delete& --- etiology --- cytology --- Human histology. Human cytology --- Human genetics --- Gastroenterology --- Metabolism --- Regulation