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S.boulardii is used in the world as a biotherapeutic agent. S. boulardii is resistant to gastric acid, and to all class of antibiotics. As biotherapeutic agent, it has shown to be effective in travelers diarrhea, diarrhea associated with broad spectrum antibiotics, chronic diarrhea due to HIV, diarrhea occurring during continuous enteral feeding, acute gastroenteritis and in the prevention of relapses of Crohn’s disease and ulcerative colitis. Among the trophic effects of S.boulardii on the small intestive of growing rats, we have observed that the administration of the lyophilized preparation of S.boulardii ( Ultralevure, Biocodex, France) to growing rats enhanced alkaline phosphatase specific and total activity in the jejunal as well as in the ileal endoluminal fluid. To confirm that S.boulardii secretes an unknown protein displaying alkaline phosphatase activity; we immunoprecipitated the protein with a polyclonal antiserum and with the IgG purified fraction raised against a peptide of 38 amino acids highlyconservated between S.cerevisiae, S.pombe and IAP of rats and containing the motif VDDSTAGAT of enzyme activation which is triggered by the phosphortylation of a serine residue. After immunoprecipitation and westernblot, the autoradiography confirmed the presence of a signal about 63kDa. With para-nitrophenylphosphate as substrate, Km and Vmax were respectively 0,26 +/- 0,07Mm and 52,9 +/- 3,1. Peak activity occurated at Ph6 and optiomal temperature for the reaction was 40°C. To purify this protein phosphatase the essential step was an affinity chromatography column of an matrix a specific agent ligand for alkaline phosphatase : L-histidyldiabenzylphosphonic acid. ON SDS-PAGE ( 7,5%), the enzyme was purified to homogeneity without other contaminating protein band. The molecular weight was estimated to be about 63kDa, the whole enzyme protein a dimmer with two subunits (63kDaà. Rat intestinal alkaline phosphatase was prepared by the purification of brush border membranes from sucklings and hydrolysis of the glycosylphosphatidylinositol (GIP) anchor using phosphatidylinositol phospholipase C specific. On SDS-PAGE ( 7,5%), intestinal alkaline phosphatase from suckling rats ad well as alkaline phosphatase from bovine origine appeared to be pure without contaminating protein but were homodimeric subunits. The second part of our study was designed to compare the dephosphorylation properties of the 3 enzymes on their phosphorylated sites in relationship to the pH for rat IAP, bovine IAP and yeast protein phosphatase. Our data that all three enzymes dephosphorylated very actively LPS, with similar concentrations of Pi liberated. However, dephosphorylation of LPS with yeast protein active on a broader range of pH than dephosphorylation of LPS with rat IAP or Bovine IAP. In thze third experience, we have determined if yeast protein phosphatase could inhibit toxicity of LPS from E. coli 055:B5 in vivo after dephosphorylation of the toxin in vitro. Therefore, LPS was first incubated in vitro (1h) with yeast protein phosphatase (22mU). After enzyme was descarted by imminoprecipitation with protein-sepharose 4B coupled with specific anti-PP IgC and after centrifugation, the supernatant was injected to rats. Serum concentrations of TNF-α were significantly lowered in the group of rats receiving dephosphorylated LPS compared to rats intact LPS. These data show that the yeast protein phosphatase is able to reduce toxicity of LPS from E. coli 055:B5. 24 hours after IV injection of LPS to growing rats. Furthermore, those lesions were observed in the liver (inflammatory infiltrate and apoptotic bodies) but not heart, lung, kidneys, intestine or colon. Finally in a preliminary experiment, we have evaluated the effect of the yeast protein phosphatase on entetoxin A of clostridium difficile in vitro on Hela cellus. No significant difference was observed between toxicity of intact enterotoxin A and enterotoxin A incubated with protein phosphate S.boulardii est une levure non pathogène largement utilisée de par le monde comme probiotique ou agent biothérapeutique. Il est résistant à l’acidité gastrique ainsi que qu’aux antibiotiques et est indiqué dans les diarrhées du voyageur, les diarrhées associées aux antibiotiques à large spectre, aux patients soumis à une alimentation entérale à débit continu, aux gastro-entéritres aïgues, à la prolongation des rémissions chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de colite ulcéreuse. Dans le cadre de l’étude des effets trophiques de S. boulardii sur la muqueuse intestinale du rat, nous avons observé que l’administration orale du probiotique lyophilisé ( perenterol R , ultra-levure R ) à des rats sevrés en croissance ( J28) stimule l’activité endoluminale de la phosphatase alcaline jéjunale mais surtout iléale. Pour démontrer que le S. boulardii libère bien dans le jéjunum et l’iléon une nouvelle protéine ayant une activité de phosphatase, l’enzymz a été immunoprécipitée par un anticorps polyclonal réagissant visàvis d’un peptide synthétique de 38 acides aminés du S. cerevisiae contenant le motif d’activation de l’enzyme ( VTDSAAGAT), le site d’activation étant une phosphorylation de la sérine. Après western blot, l’autoradiographie a confirmé la présence d’un signal voisin de 63Kda ; Avec comme substrat du para-nitrophénylphosphate, le Km et la Vmax sont respectivement de 0,26+/- 0,07 Mm et de 52,9 +/- 3,1. le pH optimal d’activité est 6 et la température optimale eest de 40°c. En reison de son activité en fonction du pH, l’enzymz a été dénommée protéine phosphatase et non phosphatase alcaline. Pour purifier la protéine phosphatase, l’étape essentielle est une chromatographie d’affinité contenant un ligand spécifique aux phosphatase alcalines : l’acide L-histidyldiazobenzylphosphonique. La pureté de l’enzyme a été démontrée par électrophorése ‘( SDS-PAGE) avec absence
D’autres protéines contaminantes. A nouveau le poids moléculaire relatif a été préparée par purification de bordure en brosse de rat en succion et hydrolyse de l’ancre glycosylphosphatidylinositol ( GPI) par une enzyme spécifique : la phosphatidylnositol phospholipase C spécifique. En électrophorèse SDS-PAGE, tant la phospatase alcaline de rat que celle de bœuf se sont avérées pures sans protéines contaminantes. La 2ième partie de l’étude vise à comparer les propriétés de déphosphorylation des 3 enzymes : IAP de rat, IAP bovine et protéine phosphatase de levure sur le site de phosphorylation du LPS en fonction du pH. Nos résultas montrent que les 3 enzymes libérent des phosphates inorganiques en concentration équivalente dans le milieu mais que la protéine phosphatase de levure a une activité beaucoup plus étendue aux acides neutres et alcalins que les 2 autres enzymes dont les limites de déphosphorylation sont beaucoup plus étroites.Dans une 3ième expérience, nous avons déterminé dans quelle mesure la protéine phosphatase de levure inhibe la toxicité du LPS d’E.coli 055: B5 i, vivo. La toxine est préalablement incubée in vitro avec la protéine phosphatase ( 22mU) et est injectée aux rats après immunoprécipitation de l’enzyme par la protéine A-Sépharose 4B complexée avec des IgC specifiques. Le dosage sanguin du TNF , marqueur majeur d’inflammation, montre que les concentrations sériques sont significativement diminuées par rapport à celles retrouvées chez le rat auxquels la toxine intacte est administrée. La protéine phosphatase de levure réduit donc la toxicité du LPS d’E.coli 055 :B5. Vingt-quatre heures après une injection intra-veineuse de LPS à des rats en croissance, le prélèvement du fois, cœur, poumons, reins, intestin grêle et côlon montre uniquement des lésions dans le foie sans aucune lésion inflammatoire ni apoptotique dans d’autres organes. Enfin, dans une expérience préliminaire,nous avons évalué l’effet de la protéine phosphatase avec l’entérotoxine A du C.difficile in vitro sur des cellules Hela. Aucune différence significative n’a été observée enre l’entérotoxine intacte et l’entérotoxine déphosphorylée

Phosphoprotein Phosphatases --- Saccharomyces

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Phosphoprotein phosphatases --- Protein kinases --- Inhibitors

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Adrenal Cortex --- Glycogen Phosphorylase --- Phosphoprotein Phosphatases --- enzymology

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Biochemie --- Biochimie --- Biologie clinique --- Klinische biologie --- Phosphoprotein phosphatases.

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Phosphoprotein Phosphatases --- Nerve Growth Factors --- Neurons --- Nerve Regeneration --- metabolism --- pharmacology