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Veins --- Protein-Tyrosine Kinases

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Les récepteurs tyrosine kinase parmi lesquels la famille ErbB (EGFR, ErbB2, ErbB3 et ErbB4)sont connus pour avoir un rôle dans la prolifération cellulaire. Plusieurs de leurs inhibiteurs sont utilisés dans les traitements anti-cancéreux. Par ailleurs, le calcium cytoplasmique participe également à la régulation de la prolifération cellulaire.En 2012, notre laboratoire a démontré, dans les cellules AS49,que l'activation du récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor), un récepteur tyrosine kinase, mène à la vidange du calcium réticulaire qui est suivie d'une entrée de Ca2+ par le canal membranaire TRPCl (Transient Receptor Potential Channel 1). Ce canal ionique est connu pour contrôler le Store­Operated Calcium Entry (SOCE) dans les cellules A549. Cette entrée de Ca2 active à son tour le récepteur à l'EGF (EGFR).Dans ce travail, nous avons investigué l'hypothèse d'une modulation du SOCE par l'EGFR. Nous n'avons pas pu mettre en évidence de modulation du SOCE par différents inhibiteurs spécifiques de l'EGFR. Cependant, le lapatinib, qui inhibe l'EGFR et ErbB2,un autre membre de la famille ErbB, diminue de manière significative le SOCE.Plusieurs sites de phosphorylation par l'EGFR et ErBb2 ont été mis en évidence in silico sur les protéines TRPCl et STIMl, un senseur calcique impliqué dans le SOCE. Ces sites de phosphorylation ont été étudiés par immunoprécipitation.Étant donné que l'inhibition de l'EGFR seul ne semble pas impliquée dans la modulation du SOCE, l'effet du lapatinib sur l'entrée calcique suite à la vidange du RE passerait par l'inhibition de ErbB2. Receptors tyrosine kinase of the ErbB family (EGFR, ErbB2, ErbB3 and ErbB4) are known to be involved in cell proliferation. Some of their inhibitors are used is cancer treatment. Besides, cytosolic calcium also participates in the regulation of cell proliferation. In 2012, our team demonstrated that EGFR activation in A549 cells leads to calcium depletion of the endoplasmic reticulum, followed by a calcium entry thought the membrane channel TRPC1 (Transient Receptor Potential Channel 1). This ion channel is known to control the Store-Operated Calcium Entry (SOCE) in A549 cells. This calcium entry activates, in its turn, EGFR. Here, we tested the hypothesis of a SOCE modulation by EGFR. Using different specific EGFR inhibitors, we couldn’t’ observe a SOCE modulation. However, the lapatinib, an inhibitor of EGFR and ErbB2, significantly decreased the SOCE. Several phosphorylation sites by EGFR and ErbB2 were highlighted in silico on TRPC1 and STIM1, a calcium-sensing protein involved in the SOCE. These phosphorylation sites were studied by immunoprecipitation. Since the inhibition of EGFR alone doesn’t seem to modulate the SOCE, the decrease observed in presence of lapanitib should involve ErbB2 inhibition.

Receptor Protein-Tyrosine Kinases --- Endoplasmic Reticulum

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Since the very recent discovery of mutations in the physiopathology of non-small­ cell lung cancer, research has greatly evolved in terms of molecular diagnosis technologies as well as in the development of targeted therapies, with tyrosine kinase inhibitors being the topic of this thesis. Currently, those two fields combined have become an essential role into routine clinical practice, leading to the possibility of a more personalized medicine. Nowadays, when advanced non-small-cell lung cancer, with adenocarcinoma subtype, is diagnosed, molecular diagnosis in order to detect EGFR, ALK and ROSI genetic alteration is being carried out. If a "positive" mutation is found, a tyrosine kinase inhibitor will be given as first-line treatment. Within this context, those molecules offer better efficiency and security than conventional chemotherapy, and improve the patient's quality of life. Despite obvious benefits of these therapies, acquired resistance during treatment poses considerable challenges subject to many ongoing studies. Depuis la récente découverte de mutations impliquées dans la physiopathologie du cancer du poumon non-à-petites cellules, les recherches ont évolué et continuent d'évoluer de manière considérable, autant en ce qui concerne les techniques d'analyse moléculaire que le développement de thérapies ciblées, dont les inhibiteurs de tyrosine kinase qui constituent le sujet de ce travail. A ce jour, l'association de ces deux domaines est devenue indispensable dans la pratique clinique routinière, et ce, dans le but de se diriger vers une médecine plus personnalisée. En effet, à l'heure actuelle, en cas de diagnostic de cancer pulmonaire non-à­ petites cellules en stade avancé et avec pour sous-type histologique l’adénocarcinome, une analyse moléculaire est réalisée afin de vérifier la présence éventuelle d'altérations génétiques sur les gènes EGFR, ALK et ROSI. Si tel est le cas, c'est un inhibiteur de tyrosine kinase qui sera donné en première intention de traitement. En effet, dans ce cadre, ces molécules s'avèrent plus efficaces que .la chimiothérapie conventionnelle ainsi qu'elles démontrent un profil de sécurité nettement meilleur et améliorent la qualité de vie du patient. Malgré ces importants bénéfices, l'apparition de résistances à ces thérapies au cours du traitement représente un challenge considérable sur lequel de nombreuses études se penchent.

Protein-Tyrosine Kinases --- Protein-Tyrosine Kinases --- Adenocarcinoma, Bronchiolo-Alveolar --- Molecular Targeted Therapy

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Platelet-derived growth factor receptors (PDGFRa and PDGFR) are tyrosine kinase receptors that have stimulatory effects on cell proliferation and motility. Genetie alterations of these receptors cause a permanent signal via different signal transduction cascades and are responsible for different types of cancers. These gene alterations include chromosomal rearrangements, like the fusion FIP lLl-PDGFRa (FPa), created by an internai deletion onchromosome 4 and found in myeloid neoplasms associated with hypereosinophilia. Point mutations have also been described, especially PDGFRa0842v in gastrointestinal stroma} tumors. Our laboratory performed systematic directed mutagenesis to find which tyrosine residues are important for FPa signaling. This study showed that only the tyrosine at position 720 was necessary for cell proliferation and signaling through STAT5 and MAP kinases induced by FPa. PDGFRa recruits the phosphotyrosine phosphatase SHP2 via phosphorylated Y720. Therefore, we wondered if SHP2 was important in cell proliferation induced by FPa. Furthermore, the implication of Tyr720 in the activity of other mutants, Iike PDGFRa0842v, isnot yet known. Thus, the purpose of this work is to study the role of SHP2 in cell proliferation and signaling induced by mutated PDGFRs. Firstly, we inhibited SHP2 expression with shRNA, in Ba/F3 cells expressing either FPa or PDGFRa0842v. Our results indicate that SHP2 seems to be necessary for cell proliferation induced by these two mutants and for the activation of the MAPK pathway. However, SHP2 seems Iess important downstream of the wild-type receptor. Then, we introduced the point mutation Tyr720Phe in PDGFRa0842v. Our experiments show that the residue Y720 is important for cell proliferation induced by PDGFRa0842v and the activation of the MAPK pathway, but not for STAT5 activation. To conclude, it appears that PDGFRa.0842v behaves similarly to FPa : both mutants recruit SHP2 via Tyr720, causing activation of the MAPK pathway and cell transformation. Nevertheless,the mechanism of STAT5 activation may differ downstream these two mutants. The substrates of SHP2 that are responsible for the MAPK pathway activation remain to be determined. Les facteurs de croissance dérivés des plaquettes ou PDGFs se fixent sur deux récepteurs (PDGFRa et PDGFRP) qui possèdent une activité tyrosine kinase et qui sont impliqués dans la prolifération et la migration cellulaire. Des altérations génétiques de ces récepteurs entrainent une activation constitutive de voies de signalisation causant différents types de cancers. Parmi ces altérations, on retrouve des réarrangements chromosomiques, comme une délétion au sein du chromosome 4 menant à une protéine de fusion : FIPI LI-PDGFRa (FPa), que l'on peut identifier dans certains néoplasmes myéloïdes associées à une hyperéosinophilie. Des mutations ponctuelles ont également été décrites, notammentPDGFRa0842v, un mutant impliqué dans des tumeurs gastrointestinales.Notre laboratoire a recherché par mutagenèse systématique les tyrosines du récepteur impliquées dans la signalisation par FPa. Cette étude a montré qu'une seule tyrosine en position 720 est nécessaire pour la prolifération ainsi que l'activation de STATS et de la voie ERK induites par FPa. Le PDGFRa sauvage lie la protéine tyrosine phosphatase SHP2 au niveau du résidu Tyr720 phosphorylé. Dès lors, la question se pose de savoir si la prolifération induite par FPa implique SHP2. En outre, la participation du résidu Tyr720 dansl'activité oncogénique d'autres mutants tel que le PDGFRa0842v reste à déterminer. Le but de ce travail est donc d'étudier le rôle joué par SHP2 dans la prolifération cellulaire induite par des PDGFRs mutés ainsi que sa place dans les voies de signalisation impliquées.Premièrement, nous avons inhibé l'expression de SHP2 à l'aide de shARN, dans des cellules Ba/F3 exprimant soit FPa soit le mutant PDGFRa0842v. Les résultats montrent que SHP2 semble nécessaire à la prolifération cellulaire induite par ces mutants ainsi qu'à l'activation de la voie ERK. Par contre, SHP2 semble jouer un rôle beaucoup moins important en aval du récepteur sauvage. Ensuite, nous avons introduit la mutation Tyr720Phe dans PDGFRa0842v.Nos expériences montrent que la Tyr720 est nécessaire à la prolifération cellulaire induite par PDGFRav 0842et à l'activation de la voie ERK, mais pas à la phosphorylation de STATS. En conclusion, il semblerait donc que PDGFRa0842v se comporte de la manière similaire à FPa : ces deux mutants recrutent SHP2 via la Tyr720, conduisant à l'activation de la voie ERK et à la transformation des cellules. Cependant, le mécanisme d'activation de STAT5 en aval de ces deux mutants semble être différent. Les substrats de SHP2 permettant l'activation de la voie ERK restent encore à déterminer.

Receptors, Platelet-Derived Growth Factor --- Receptors Protein-Tyrosine Kinases --- Neoplasms

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Cell Transformation, Neoplastic --- Protein-Tyrosine Kinases --- Proto-Oncogenes --- Recombinant Fusion Proteins --- genetics --- genetics --- genetics