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L'acide aminé L-glutamate constitue le neurotransmetteur excitateur majeur du système nerveux central des mammifères. Outre ce rôle clef dans la transmission des signaux entre les neurones, le glutamate intervient aussi dans les phénomènes de mémorisation, d'apprentissage, d'adaptation et de plasticité neuronale. Cependant, de par son rôle activateur, il peut aussi être impliqué dans des phénomènes d'excitotoxité, provoquant des dommages neuronaux menant à une mort cellulaire. Due à une hyperstimulation des récepteurs glutamatergiques neuronaux, l'excitotoxicité peut être évitée par la régulation fine des concentrations synaptiques en glutamate. Ne pouvant être métabolisé par une enzyme dans la synapse après avoir exercé ses effets, le glutamate doit impérativement être éliminé par des protéines spécifiques, à savoir les transporteurs du glutamate. Cette fonction sera majoritairement accomplie par les astrocytes présents au niveau de la fente synaptique. Vu le rôle essentiel des astrocytes dans le maintien de l'homéostasie glutamatergique, nous nous sommes particulièrement intéressés à la régulation des cibles moléculaires du glutamate sur les astrocytes ; en particulier le récepteur astrocytaire mGluR5 qui s'est avéré capable de moduler positivement l'activité des transporteurs du glutamate dans un environnement mimant la gliose réactionnelle. Considérant que dans divers processus pathologiques, une réaction inflammatoire se déclenche au sein du SNC et que cette dernière se développe en grande partie au départ des cellules microgliales, nous nous sommes interrogés quant à l'influence de la neuroinflammation sur l'expression du mGluR5 astrocytaire. Pour modéliser la réaction inflammatoire, nous avons utilisé des cultures primaires enrichies en cellules microgliales, dont l'activation a été réalisée par exposition au LPS, agent mimant une infection bactérienne. Cette activation fut objectivée par la mesure de l'expression génétique de médiateur s inflammatoires. Après avoir cultivés les astrocytes dans cet environnement inflammatoire, nous avons étudié l'expression du récepteur mGluR5 au niveau protéique et génétique. Ces études en western blot et en PCR en temps réel ont conduit à des résultats cohérents, mettant en évidence une diminution significative du mGluR5. L'effet direct du LPS sur le mGluR5 fut lui aussi testé, ainsi que celui d'une cytokine clé de la réponse inflammatoire, le TNFa. Alors que le LPS n'a pratiquement aucune influence sur le mGluR5, le TNFa lui s'est avéré mimer les effets du contexte inflammatoire. Ces données expérimentales indiquent que le déclenchement d'une réponse inflammatoire dans le parenchyme nerveux au cours de diverses pathologies pourrait altérer l'expression du récepteur mGluR5 . Ce dernier possède diverses fonctions au niveau astrocytaire et sa régulation n'est probablement pas sans conséquence sur la physiologie de ces cellules gliales. The amino acid L-glutamate constitutes the major excitatory neurotransmitter of the central nervous system of the mammals. Beside this key role in the signal transmission between the neurones, glutamate is also involved in memory acquisition, leaming, and neuronal plasticity.However, because of its excitatory influence, it can also be implicated in excitotoxic phenomena, causing neuronal damages leading to a cellular death.As excitotoxicity is directly related to the excessive stimulation of glutamatergic neuronal receptors, it can be prevented by a fine regulation of synaptic glutamate concentrations. Since glutamate cannot be metabolized within the synapse after exerting its effects, it necessarily has to be eliminated by specific membrane proteins. namely glutamate transporters. This uptake fonction is mainly accomplished the astrocytes surrounding communicating neurons. Considering the essential role of the astrocyte in maintaining the glutamatergic homeostasis, we are interested in studying the regulation of molecular targets of glutamate on the astrocytes, in particular, the glutamate receptor mGlu R5 which was proven to positively modulate the activity of glutamate transporters in astrocytes grown in a chemical environment simulating reactive gliosis.In various pathological circumstances, an inflammatory reaction develops into the CNS and this reaction is mainly initiated in microglial cells. Therefore, the question that was addressed during this student research project was to evaluate the influence neuroinflammation on the expression of mGluR5 in cultured astrocytes. An in vitro model of neuroinflammation was generated using primary cultures of cortical cells enriched in microglial cells. These cultures were activated by exposure to LPS, an agent that simulates a bacteriological infection. This activation was validated by measuring the enhanced genetic expression of inflammatory mediators. The conditioned medium obtained from these activated microglial cells was transferred to primary cultures of astrocytes and after this treatment, the expression of the mGluR5 receptor was examined by Western blot analysis and real time PCR. Both approaches · indicated that mediators released by the microglial cells caused a robust down-regulation of mGluR5. In parallel, the direct influence of LPS on the astrocytes was also evaluated, as well as the regulation caused by exposing these cells to the inflammatory cytokine, TNFa. While LPS had practically no influence on mGluR5 expression, TNFa was found to mimic the effect of microglia conditioned medium.Together, these experimental data show that the development of an inflammatory response in the nervous parenchyma during diverse pathologies could alter the expression of the mGluR5 receptor. As this receptor possesses several fonctions at the astrocytic level, such regulation would certainly influence the functional properties of these glial cells, and this should be taken into account when considering this receptor as a putative pharmacological targets of nervous disorders.

Microglia --- Receptor, Metabotropic Glutamate 5 --- Astrocytes

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La douleur représente sans aucun doute l'une des manifestations les plus fréquemment rencontrées dans le milieu médical. Même si, en un peu plus d'un siècle, moult solutions ont été trouvées afin de diminuer voire neutraliser la douleur aigüe, la douleur chronique reste une problématique médicale de premier plan. Ainsi, la plupart des analgésiques conventionnels ne présentent qu'une efficacité limitée dans le traitement de cette pathologie chronique, laquelle constitue une source majeure d'invalidité pour de nombreux patients. Par ailleurs, les mécanismes à l'origine du développement de l'hyperalgésie la caractérisant restent méconnus. Parmi les cibles intéressantes potentiellement impliquées dans le développement de la douleur chronique, deux ont particulièrement retenu notre attention. D'une part, nous nous sommes intéressés au récepteur métabotropique du glutamate de type 5 (mGluR5), un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) impliqué notamment dans le contrôle de la transmission excitatrice au niveau spinal et dans la régulation de la synthèse d'endocannabinoides, neuromédiateurs importants du contrôle nociceptif. D'autre part, nous avons étudié les protéines ROS (regulator of G-protein signaling) dont le rôle consiste à faciliter l'inactivation des protéines G, limitant ainsi les réponses déclenchées par divers RCPG.Sachant que chez des rats ayant subi une ligature partielle et unilatérale du nerf sciatique- PSNL, un modèle expérimental validé de douleur chronique neuropathique -, on observait une augmentation de l'expression de l 'ARNm de RGS2 (Bosier et al., non publié) et RGS4 (Garnier et al. 2003) au niveau des ganglions spinaux et de la corne dorsale ipsilatérale de la moelle épinière, il nous parut intéressant de reproduire cette régulation sur des astrocytes cultivés. Au cours de ce travail, nous avons donc montré que l'expression de l'ARNm des protéines RGS était modifiée lors de l'exposition de cultures d'astrocytes à une cytokine inflammatoire : l'interleukine-1eGFPß· Au contraire, le TNFa. ne semblait pas faire varier cette expression. En lien avec cette observation, nous avons entamé l'étude de l'influence exercée par différentes protéines RGS sur la signalisation induite par le mGluR5. En particulier, nous avons examiné le profil oscillatoire de la mobilisation de calcium intracellulaire, spécifique de certains RCPG dont le récepteur mGluR5 . Ces travaux ont été initiés dans un modèle de cellules transfectées (CHO-/ac-mGluR5) exprimant le récepteur mGluR5 sous contrôle d'un promoteur inductible. Plusieurs constructions plasmidiques ont été générées, afin d'exprimer le gène codant pour mes RGS (en particulier RGS4) dans un vecteur bicistronique codant pour la protéine eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein). Ces nouveaux vecteurs permettent l'expression concomitante des protéines RGS4 et eGFP facilitant la discrimination entre les cellules surexprimant ou non les protéines RGS recombinantes. Après avoir validé ces constructions, nos résultats préliminaires sur cellules CHO suggèrent que le profil des réponses aux agonistes du récepteur mGluR5 est modifié par la surexpression de la protéine RGS4. Cependant de plus amples recherches sont nécessaires pour conforter cette observation. En parallèle, des expériences sont envisagées sur cultures primaires d'astrocytes qui seront également transfectées avec ces constructions. Ces résultats préliminaires soutiennent notre hypothèse qu'un remodelage moléculaire au niveau des voies de signalisation dans les astrocytes pourrait participer à la sensibilisation de la transmissionde la douleur au niveau spinal. Ainsi, l'influence des protéines RGS sur les cascades signalétiques induites par les agonistes du récepteur mGluR5 pourrai altérer le contrôle de divers processus calcium-dépendants, tels la synthèse d'endocannabinoïdes ou le relargage de neurotransmetteurs.Ceux-ci étant impliqués dans le contrôle de la transmission nociceptive, les protéines RGS pourraient représentr une cible thérapeutique, méritant d'être approfondie dans le traitement de la douleur chronique. Pain is undoubtedly one of the most frequent events encountered in the medical field. Even if over the last century many solutions have been found to reduce or neutralize acute pain, chronic pain is a medical problem of the first order. Indeed most conventional analgesics are limited in treating this type of pain which is a major source of disability for several patients. The mechanisms behind the development of this hyperalgesia remain unknown. Among the interesting targets that can potentially be involved in the development of chronic pain, two in particular caught our attention. On the one hand we are interested in metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5), a G protein­ coupled receptor (GPCR) involved in the control of excitatory transmission at the spinal level as well as in regulating the synthesis of endocannabinoids, important neurotransmitters of nociceptive control. On the other hand we have studied the RGS (regulator of G protein signaling) proteins which facilitate the inactivation of G proteins thus limiting the responses triggered by various GPCRs.ln rats with unilateral and partial sciatic nerve ligation - PSNL, a validated experimental model of chronic neuropathic pain - we observed an increase in mRNA expression of RGS2 (Bosier et al, non-published) and RGS4 (Garnier et al. 2003) in dorsal root ganglia and in the ipsilateral dorsal horn of the spinal cord. Therefore, it seemed interesting to replicate this regulation on astrocyte cultures. In this work we have shown that the mRNA expression of RGS proteins was changed upon exposure of astrocyte cultures with the inflammatory cytokine interleukin-1 .In contrast TNFa did not vary this expression. ln connection with this observation we started the study of the influence of RGS proteins on signaling associated with mGluR5. In particular we examined the oscillatory profile of intracellular calcium mobilization specific to some GPCRs such as mGluR5. This work was initiated in a model of transfected (CHO-/ac-mGluR5) cells expressing mGluR5 under control of an inducible promoter.Several plasmid constructs were generated in order to express the gene encoding the RGS (especially RGS4) in a bicistronic vector encoding eGFP (enhanced green fluorescent protein). These new vectors allow the concomitant expression of proteins RGS4 and eGFP, facilitating discrimination between cells overexpressing or not the recombinant RGS proteins. After validating these constructs, our preliminary data suggest that CHO responses to mGluR5 agonists are altered by overexpression of RGS4 protein. However further research needed to confirm this observation. In parallel, experiments are planned on primary cultures of astrocytes which will also be transfected with these constructs.These preliminary results support our hypothesis that molecular remodeling at signaling pathway in astrocytes could be involved in the sensitization of the pain transm ission at the spinal level. Thus the influence of RGS proteins on signaling cascades induced by mGluR5 agonists could alter the control of various calcium-dependent processes, such as endocannabinoid synthesis or neurotransmitter release. Because these events are involved in the control of nociceptive transmission, RGS proteins may represent a therapeutic target that merits further investigation in chronic pain.

Chronic Pain --- RGS Proteins --- Receptor, Metabotropic Glutamate 5