Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

General ecology and biosociology --- General microbiology --- Micro-organisme --- microorganisms --- Champignon --- Fungi --- Virus --- viruses --- Écologie microbienne --- microbial ecology --- Contamination biologique --- Biological contamination --- Relation hôte pathogène --- Host pathogen relations --- Biosynthèse --- Biosynthesis --- Bioremédiation --- Bioremediation --- genomes --- Génotype --- genotypes --- ADN --- DNA --- Marqueur génétique --- genetic markers --- Séquence nucléotidique --- Nucleotide sequence --- Transcription --- transcription --- Génétique des populations --- population genetics --- Microbial genomics --- Microbial genomics. --- Data processing. --- viruses. --- Bioremediation. --- DNA. --- transcription.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De meeste planten verdedigen zich met succes tegen potentiëel pathogene micro-organismen door middel van reeds aanwezige afweermechanismen. Ze activeren echter hun intrinsiek immuunsysteem wanneer deze eerste verdedigingslinie wordt doorbroken, hetgeen leidt tot een brede waaier van verdedigingsmechanismen. Dikwijls worden deze vergezeld door een actief geprogrammeerde celdood of hypersensitieve respons (HR), die verdere pathogeengroei verhindert. Om dergelijke regulatoren van celdood in planten te identificeren, werd in een voorgaande studie een grootschalige in-planta functionele screening uitgevoerd. Hierbij werd gebruik gemaakt van een potato virus X (PVX)-afgeleid overexpressiesysteem en een cDNA-bibliotheek aangemaakt van paraquat behandelde bladeren van Nicotiana benthamiana . Na een screening van 30.000 cDNA klonen werd een ADP-ribosylatiefactor 1 (ARF1) geïdentificeerd die, na overexpressie in N. benthamiana , een snelle celdood veroorzaakt (Berberich et al ., Iwate Biotechnology Research Center, Japan, niet gepubliceerde resultaten). Dit doctoraatswerk (deel B) beoogde de functionele karakterisatie van het ARF1 -gen, alsook de mechanismen die aan de basis liggen van zijn potentiële rol in relatie tot plantenafweer. ARF’s zijn kleine GTP-bindingsproteïnen die behoren tot de Ras superfamilie van GTPasen. ARF1 maakt deel uit van een genfamilie in eukaryoten, en dit werd ook bevestigd door Southern blot analyze in Nicotiana spp. Dit gen is gekend voor zijn tussenkomst in blaasjestransport in planten, zoals werd bevestigd door aanwezigheid van het proteïne op subcellulair niveau ter hoogte van (endo)membranen alsook het cytosol. Daarenboven werden cruciale domeinen voor de functie van het ARF1-proteïne geïdentificeerd. Inactieve T31N- en G2D-mutanten van ARF1 vertoonden een vertraagde celdood na overexpressie, terwijl een constitutief actieve Q71L-mutant een snellere celdood vertoonde in vergelijking met het wild-type. Verder werd aangetoond dat ARF1 een belangrijke rol speelt in plantverdediging. Northern blot analyze toonde aan dat de hoeveelheid ARF1 -transcripten sterk toenam na behandeling met paraquat, behandeling met de INF1-elicitor van de oomyceet Phytophthora infestans , na interactie tussen het N-genproduct en tobacco mosaic virus (TMV), alsook na inoculatie met de niet-gastheer bacteriële pathogeen Pseudomonas cichorii . Langs de andere kant werd het ARF1 -transcriptniveau in N. benthamiana niet beïnvloed door inoculatie met de virulente bacteriële pathogeen Pseudomonas syringae pv. tabaci . Met behulp van een tobacco rattle virus (TRV)-afgeleide silencingvector werd ARF1 neerwaarts gereguleerd, wat resulteerde in een afwijkend fenotype en verlies van niet-gastheer resistentie ten opzichte van P. cichorii . De groei van deze pathogeen in ARF1 neerwaarts gereguleerde planten was meer dan tienvoudig hoger in vergelijking met controle planten. Daarnaast veroorzaakte neerwaartse regulering van het ARF1 -gen ook een verlies van resistentie ten opzichte van TMV in N. benthamiana die het N -resistentiegen bevat. In tegenstelling hiermee, maar in overeenkomst met de genexpressie-data, had neerwaartse regulering van ARF1 geen verandering van gevoeligheid van N. benthamiana tegen de pathogeen P. syringae pv. tabaci tot gevolg. Deze resultaten suggereren dat ARF1 in N. benthamiana belangrijk is voor de niet-gastheer resistentie ten opzichte van bacteriën alsook voor de resistentie waarbij het N ) door middel van Southern blotting. Het 3’ uiteinde van dit potentieel banaan- ARF1 werd gekloneerd door een combinatie van 3’RACE-PCR en TAIL-PCR. In een eerste stap naar de grootschalige analyze van plant-schimmel interacties in banaan, werd in het tweede deel (deel A) van dit werk een globale genexpressie-analyze uitgevoerd, om het transcriptoom van een banaanblad te ontrafelen. Hierbij werd nagegaan of een verbeterde Seriële Analyse van Gen Expressie (SuperSAGE) een efficiënte manier is om het transcript profiel te onderzoeken in banaan. Daarnaast werd onderzocht of de bekomen ‘tag’ sequenties lang genoeg zijn om eenduidige annotering toe te laten, alsook om de overeenkomstige gensequenties te isoleren en alzo snel nieuwe genen te ontdekken. SuperSAGE werd voor de eerste maal met succes toegepast om een globaal expressieprofiel te bekomen van een niet-model organisme. In totaal werden er 10.196 tags aangemaakt van bladweefsel, afkomstig van 5.292 tot expressie gebrachte genen. Negenenveertig ‘tags’ van de 100 meest abundant tot expressie gebrachte genen werden geannoteerd door homologie met cDNA- en EST-sequenties. Het werd bovendien aangetoond dat de 26 bp SuperSAGE-tags voldoende specifiek zijn om directe annotering toe te laten op genomische sequenties. Typerend voor bladweefsel toonde het transcript-profiel aan dat de overgrote meerderheid van abundante transcripten een rol spelen bij energieproductie, en vooral fotosynthese. Desondanks was de meest overvloedig aanwezige ‘tag’ afkomstig van een type 3 metallothioneinetranscript dat nagenoeg 3% van alle aanwezige transcripten vertegenwoordigde. Daarnaast maakte analyze van de geannoteerde ‘tags’ het mogelijk om antisense transcriptie in het banaangenoom aan te tonen. Tot slot werden onbekende SuperSAGE-tags gebruikt in een geoptimaliseerd 3’RACE-protocol, wat toeliet om 95% van de ‘tags’ te verlengen en vervolgens 40% van deze verlengde tags te annoteren. Echter, in geval geen homologie werd gevonden tussen de verlengde tag en een EST-sequentie, werd aangetoond dat TAIL-PCR toelaat om snel te ‘wandelen’ in het overeenkomende gen en het alzo te identificeren. De klonering van de volledige gensequentie van een NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase werd beschreven. Bovendien werd ook de intron-exonstructuur van dit enzyme, dat een sleutelrol speelt bij de biosynthese van chlorofyl, getoond. Een combinatie van SuperSAGE met 3’RACE en TAIL-PCR is dus een krachtige techniek voor transcriptoomanalyze in een niet-model gewas. Most plants successfully protect themselves against potential pathogenic micro-organisms by preformed defences. When this first line of defence is broken they have the ability to activate their innate immunity. This results in a wide array of basal defence responses, frequently accompanied by an active programmed cell death. This hypersensitive response (HR) restricts further pathogen growth. To identify positive regulators of plant cell death, a high-throughput functional screen was earlier performed using in planta potato virus X (PVX)-based overexpression of a cDNA library derived from paraquat-treated Nicotiana benthamiana leaves. The screening of 30,000 cDNA clones allowed the identification of an ADP-ribosylation factor 1 (ARF1) causing fast cell death when overexpressed in N. benthamiana (Berberich et al ., Iwate Biotechnology Research Center, Japan, unpublished results). The goal of the present work (Part B) was to functionally characterise the ARF1 gene and the mechanisms underlying its potential involvement in plant defence. ARFs are small GTP-binding proteins belonging to the Ras superfamily of GTPases. Southern blot analysis demonstrated that ARF1 was a member of a gene family in Nicotiana spp., as had been previously shown in other eukaryotes. The ARF1 gene is known to be involved in vesicle trafficking in plants as evidenced by its subcellular localisation on (endo)membranes, as well as the cytosol. Moreover, crucial domains for ARF1 functioning were identified. Whereas inactive T31N and G2D mutants of ARF1 triggered a delayed cell death upon overexpression, a constitutively active Q71L ARF1 mutant exhibited faster cell death, compared to the wild type ARF1. We further demonstrated that ARF1 plays a crucial role in plant defence. Northern blot analysis revealed that ARF1 transcript level strongly increased following treatment with paraquat, treatment with the oomycete Phytophthora infestans elicitor INF1, by interaction between the N gene and tobacco mosaic virus (TMV), as well as inoculation with the non-host bacterial pathogen Pseudomonas cichorii . On the other hand, inoculation with the virulent bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. tabaci did not alter ARF1 expression in N. benthamiana . Virus-induced gene silencing (VIGS) of ARF1 in N. benthamiana using a tobacco rattle virus (TRV)-based silencing vector resulted in a stunted phenotype and severely compromised non-host resistance towards P. cichorii . Furthermore, growth of this pathogen in ARF1 silenced plants was more than 10-fold higher than in control unsilenced plants. ARF1 silencing also hampered resistance towards TMV in N. benthamiana containing the N resistance gene. In contrast, and in accordance with ARF1 gene expression data, silencing of ARF1 did not alter susceptibility of N. benthamiana towards the pathogen P. syringae pv. tabaci . These results strongly suggest the involvement of ARF1 in non-host resistance to bacteria and N gene mediated resistance in N. benthamiana , possibly through an interaction with a member of the Rho family of GTPases, whose role in HR induction are well characterised. Finally, the presence of sequences homologous to Nb ARF1 in banana ( Musa acuminata ) was revealed by Southern blot analysis. The 3’ end of a putative banana ARF1 was cloned by combining 3’RACE PCR and TAIL-PCR. As a first step towards high-throughput analysis of plant-fungus interaction in banana, in the second part (Part A) of this work, a global gene expression analysis was performed to unravel the banana leaf transcriptome. It was investigated whether an improved Serial Analysis of Gene Expression (SuperSAGE) could be an efficient mean for transcript profiling in banana. Furthermore, it was explored if the obtained transcript-derived tags permit unambiguous annotation and walking in the corresponding genes, thereby permitting rapid gene discovery. For the first time, SuperSAGE was successfully applied to characterise the global gene expression pattern of a non-model organism. A total of 10,196 tags were generated from leaf tissue, representing 5,292 expressed genes. Forty-nine tags of the top 100 most abundantly expressed transcripts were annotated by homology to cDNA or EST sequences. It was demonstrated that the 26-bp SuperSAGE tags are indeed long enough to allow species-specific annotation to genomic sequences. Typically for leaf tissue, analysis of the transcript profiles showed that the majority of the abundant transcripts are involved in energy production, mainly photosynthesis. However, the most abundant tag was derived from a type 3 metallothionein transcript, which accounted for nearly 3% of total transcripts analysed. Analysis of tag annotation also revealed evidence for antisense transcription in the banana genome. Lastly, unknown SuperSAGE tags were applied in an improved 3’RACE protocol, leading to successful tag elongation in 95% of the tags tested. Moreover, for more than 40% of these tags, annotation was feasible following tag elongation. For extended tags without a matching EST sequence, it was demonstrated that TAIL-PCR provides a rapid means for walking in the corresponding gene, allowing its identification. The recovery of a full gene sequence as well as the intron-exon gene structure of a novel NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase, the key enzyme in chlorophyll biosynthesis, is described. Taken together, SuperSAGE in conjunction with 3’RACE and TAIL-PCR is a powerful tool for transcriptomics of non-model, but otherwise important organisms. Micro-organismen zoals bacteriën, virussen en schimmels, vormen een wereldwijde bedreiging voor landbouwgewassen. De impact van deze pathogenen op de landbouwproductie kan men verminderen door gebruik te maken van genetisch verbeterde gewassen, gecreëerd door kruisingen of genetische manipulatie. Dit vereist echter inzicht in ziekteresistentiemechanismen bij planten. Het is algemeen geweten dat de meeste planten zich verdedigen tegen pathogene micro-organismen door enerzijds de productie van een brede waaier van biologisch actieve stoffen, en anderzijds door een actief geprogrammeerde celdood, die verdere pathogeengroei kan verhinderen. Om dergelijke regulatoren van celdood in planten te identificeren, werd in een voorgaande studie een grootschalige screening uitgevoerd in Nicotiana benthamiana , een plant die dikwijls wordt gebruikt als model voor de studie van plant-microbiële interacties. Hierbij werd het ARF1 -gen geïdentificeerd, dat na activering een snelle celdood veroorzaakt. In dit doctoraatswerk werd getracht om de rol van het ARF1 -gen in plantenafweer te achterhalen. ARF1 is een proteïne, dat verantwoordelijk is voor de vorming van kleine transportblaasjes in de plantencel, die gebruikt worden voor transport van o.a. bouwstenen tussen celcompartimenten. Onderzoek toonde onder meer aan dat het ARF1 -gen sterk werd geactiveerd na inoculatie van planten met het tabakmozaïekvirus (TMV) en de niet-gastheer bacteriële pathogeen Pseudomonas cichorii , die beiden onder normale omstandigheden geen ziekte kunnen veroorzaken in N. benthamiana . Daarnaast bleek dat de normale groei en ontwikkeling van de plant werd verstoord indien de vorming van ARF1 proteïne werd verhinderd. Bovendien resulteerde dit in sterk verlies van resistentie ten opzichte van P. cichorii en een gedeeltelijk verlies van resistentie ten opzichte van TMV. Deze resultaten suggereren dat het ARF1 -gen belangrijk is voor de niet-gastheer resistentie ten opzichte van P. cichorii alsook voor de resistentie tegen TMV. Tot slot werd de aanwezigheid van DNA-sequenties gelijkend op het ARF1 -gen van N. benthamiana aangetoond in banaan en werd een gedeelte van dit potentieel banaan- ARF1 geïsoleerd. In een tweede deel van dit doctoraatsonderzoek werd nagegaan welke genen actief zijn in bladweefsel van het niet-model gewas banaan. Hiervoor werd SuperSAGE (Seriële Analyse van Gen Expressie) gebruikt, een techniek die toelaat om kleine DNA-sequenties te isoleren uit actieve genen. In totaal werden er 10.196 sequenties geïsoleerd, afkomstig van 5.292 verschillende actieve genen. Zoals verwacht voor bladweefsel werd aangetoond dat de overgrote meerderheid van deze genen een rol spelen bij energieproductie, en vooral fotosynthese. Voor een aantal van deze korte DNA-sequenties kon echter het overeenkomstige gen niet worden geïdentificeerd, mede door de beperkte hoeveelheid gekende DNA-sequenties van banaan in publieke databanken. Daarom werd een PCR-gebaseerde methode ontwikkeld om dergelijke sequenties te verlengen en zo het overeenkomstige ongekende gen te identificeren. Dit liet toe om de volledige sequentie van het POR -gen, dat een sleutelrol speelt bij de biosynthese van chlorofyl, te isoleren. Een combinatie van SuperSAGE en PCR is dus een krachtige techniek voor de identificatie van nieuwe genen in een niet-model gewas als banaan. Bovendien bied deze techniek mogelijkheden voor de identificatie van genen in plant-microbiële interacties.

Nicotiana tabacum --- Musa acuminata --- Maladie des plantes --- Plant diseases --- Relation hôte pathogène --- Host pathogen relations --- Résistance aux facteurs nuisibles --- Resistance to injurious factors --- Résistance génétique --- Genetic resistance --- Code génétique --- genetic code --- Réponse de la plante --- Plant response --- Pseudomonas --- ADN --- DNA --- RAPD --- Academic collection --- 577.2 --- 634.771 --- Molecular bases of life. Molecular biology --- Musa species in general --- Theses --- 634.771 Musa species in general --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology --- DNA.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Parasitisme --- Ecology --- Host-parasite relationships --- Biodiversity --- Pests --- Ecologie --- Relations hôte-parasite --- Biodiversité --- Animaux et plantes nuisibles, Lutte biologique contre les --- Textbooks --- Biological control --- Manuels d'enseignement supérieur --- Agent pathogène --- Pathogens --- Relation hôte pathogène --- Host pathogen relations --- Pathogénèse --- pathogenesis --- Épidémiologie --- Epidemiology --- Distribution spatiale --- Spatial distribution --- Surveillance épidémiologique --- Disease surveillance --- Immunologie --- Immunology --- Écosystème --- ecosystems --- Distribution des populations --- Population distribution --- Dynamique des populations --- population dynamics --- Diversité biologique --- Écologie --- Agents de lutte biologique --- Évaluation --- evaluation --- Impact sur l'environnement --- Environmental impact --- Relations hôte-parasite --- Biodiversité --- Manuels d'enseignement supérieur --- Écologie. --- evaluation. --- Parasitisme. --- Relations hôte-parasite. --- Biodiversité. --- Agents de lutte biologique.