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2-Chlorodeoxyadenosine (CdA) is a nucleoside analogue used in the treatment of chronic lymphocytic leukaemia (CLL). This drug is toxic not only for dividing cells, in which it inhibits DNA synthesis, but also for resting cells such as lymphocytes. Recently, the leukaemia cell line EHEB, derived from a patient with CLL, was found resistant to CdA. Paradoxically, CdA increases DNA synthesis in these cells. This finding can be related to the fact that CdA also provokes an activation of thymidine kinase (TK) and of deoxycytidine kinase (dCK), which both play a crucial role in the synthesis of deoxynucleoside triphosphates, required for DNA synthesis. The aim of my work was to learn more on the activation of these enzymes by CdA, and to investigate the mechanism of this activation.
After we had noted that this activation could also be exerted by other nucleosides, we could show that increase of activity by CdA proceeds much more rapidly for dCK than for TK, which suggest that the mechanism of activation by CdA of these two enzymes is different.
Activation of TK by CdA can be suppressed by inhibitors of transcription and of translation which indicates that new synthesis of mRNA and protein are involved in the effect of CdA on TK activity. On the other hand, activation of TK by CdA can also be suppressed by staurosporine, an inhibitor of various protein kinases, suggesting that a protein kinase could mediate the effect of CdA on TK. This yet unidentified protein kinase could influence the transcription of the gene of TK, or increase the activity of TK by post-translational modification.
Activation of dCK by CdA is also strongly decreased by inhibitors of transcription and of translation. However, Western blotting of dCK show that activation of this enzyme by CdA is not explained by an increase of the amount of protein. Contrary to what is observed for TK, activation of dCK, by CdA is only weakly diminished by staurosporine. On the other hand, the effect of CdA on dCK can be mimicked by genistein, a tyrosine kinase inhibitor, suggesting that CdA could act by activating this type of protein kinase. Genistein does not increase TK activity, in accordance with the hypothesis that activation pathways for TK and dCK are different. La 2-chloro désoxyadénosine (ou CdA) est un analogue de la 2’-désoxyadénosine, utilisé dans le traitement de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Elle est toxique non seulement pour les cellules qui prolifèrent, dans lesquelles elle inhibe ka synthèse d’ADN, mais également dans les cellules quiescentes, tels les lymphocytes. Récemment, la lignée leucémique EHEB, dérivée d’une patiente souffrant de LLC, s’est montrée résistante à la CdA. Curieusement, dans ces cellules, la CdA stimule la synthèse d’ADN, ce qui peut être mis en relation avec le fait qu’elle y provoque également une activation de la thymidine kinase (TK) et de la désoxycytidine kinase (dCK), deux enzymes qui jouent un rôle crucial dans la synthèse des désoxynucléoside triphosphates, indispensables à la réplication de l’ADN. Le but de mon travail était d’en savoir plus sur l’activation de ces enzymes par la CdA, et principalement sur le mécanisme de cette activation.
Après avoir remarqué que cette activation pouvait aussi être exercée par d’autres nucléosides, nous avons montré que l’augmentation d’activité de la dCK induite par la CdA était beaucoup plus précoce que celle de le TK, suggérant un mécanisme d’activation différent pour les deux enzymes.
L’activation de la TK provoquée par la CdA peut être supprimée par des inhibiteurs de la transcription et de la traduction, indiquant que cet effet de la CdA fait intervenir une nouvelle synthèse d’ARNm et de protéine. D’autre part, l’effet de la CdA sur la TK est contrecarré par la staurosporine, un inhibiteur de nombreuses protéines kinases, indiquant qu’il pourrait faire intervenir une protéine kinase. Cette protéine kinase, encore non-identifiée, pourrait agir en augmentant l’expression du gène de la TK, ou en produisant une modification post-traductionnelle de l’enzyme.
L’activation de la cDK induite par la CdA est, elle aussi, fortement diminuée par des inhibiteurs de la transcription et de la traduction. Cependant, une analyse par Western blot montre que l’augmentation d’activité de la dCK ne peut être expliquée par une augmentation de la quantité d’enzyme. Contrairement à ce qui est observé pour la TK, l’activation de la dCK par la CdA n’est que faiblement diminuée par la staurosporine. Par contre, elle est mimée par la génistéine, un inhibiteur de protéines-tyrosines kinases, ce qui suggère que le nucléoside pourrait agir par l’intermédiaire de cette enzyme. La génistéine est sans effet sur l’activité de la TK, confirmant que les activités de la TK et de la dCK ne sont pas régulées par les mêmes mécanismes.

Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell --- Thymidine Kinase --- Phosphotransferases

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Gene Expression Regulation, Neoplastic --- Ganciclovir --- Glioma --- Thymidine Kinase --- Genetic Therapy --- Simplexvirus --- Bystander Effect --- pharmacology --- genetics --- genetics --- genetics --- physiology